银屑病发病关键基因筛选、与免疫细胞浸润关系及有治疗潜力的中药预测

潘素跃，王朴，黄巧，胡敏，彭怡，李伟佳，戚嘉慧，刘凌宇，江千帆，何玉清，2

1 广东医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系 广东医科大学医学系统生物学研究所，广东东莞 523808；2 东莞市寮步医院皮肤科

银屑病是一种常见的由多种免疫细胞介导的慢性炎症性皮肤病，常表现为皮肤红斑，其表面附着数层银白色鳞屑［1］。据调查，银屑病的全球发病率为0.9%~8.5%，我国发病率为0.5%~4.6%［2］。银屑病的病因复杂，可能与遗传、感染、免疫失调、精神应激、药物等多种因素有关，其发病机制是多种免疫细胞共同参与的免疫反应，其中以T 淋巴细胞介导为主，导致表皮细胞过度增殖以及不同程度的角质形成细胞异常分化、炎症发生及血管生成［3］。目前国际指南推荐的治疗方法主要包括局部治疗、常规全身治疗、生物疗法和免疫抑制剂等［4］。由于传统药物系统疗法不良作用明显，而生物制剂费用高昂，长期用药会导致患者依从性变差且经济负担过重［5］。因此，使用具有较好临床疗效的中药复方制剂作为治疗银屑病的替代或补充药物成为可能［6］。中药治疗银屑病应予以更多的关注，相较于其他针对银屑病生物信息学的研究侧重于关键基因筛选上，本研究通过采用CIBERSORT 反卷积算法对银屑病发病关键基因与免疫浸润水平之间的关系进行了分析，筛选出银屑病有治疗潜力的中药，为银屑病病理机制的研究和更安全有效的治疗方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源 在GEO 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）按照疾病类别为银屑病，生物类型为人类的条件检索基因表达谱。最终本研究选取 GSE166388 基因表达谱作为训练数据集，GSE2737作为验证集。其中 GSE166388含 4例份银屑病皮损组织样本与4 例份健康皮肤组织样本；GSE2737 含4 例份银屑病皮肤组织样本与3 例份健康皮肤组织样本。

1.2 银屑病发病关键基因的获取

1.2.1 银屑病高度相关差异共表达基因（DEG s）的 获取及生物学功能富集分析 ①银屑病DEGs的获取：使用 R 软件包 limma（version 3.40.6）对合并数据集按照｜log2Fc|≥1，P< 0.05 的标准要求筛选DEG s，并绘制热图以及火山图。②DEG s 富集分析：在GSEA 数据库下载 GSEA 软件（version 3.0），并 从 Molecular Signatures Database 下 载 c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt 子集合，设定最小基因集为5，最大基因集为 5 000，且当P< 0.05， FDR < 0.25作为明显富集基因集的判定标准，取交集的通路进行富集分析，对DEG s 富集最明显的5 个通路进行可视化。③银屑病相关性最高的基因模块筛选：根据标准化后的基因表达矩阵，利用加权基因共表达网络分析 （WGCNA） 包和 limma 包分别进行样本聚类，计算软阈值，构建无尺度共表达网络。通过基因显著性和模块显著性评价基因和模块之间的关联性，筛选出银屑病相关性最高的基因模块。银屑病高度相关DEG s 的功能富集：将①中获取的DEG s与模块相关性分析中相关性最高的模块取交集（高度相关DEG s）。利用 R 软件包 clusterProfiler 对高度相关DEG s 的生物过程 （BP）、分子功能（MF）以及细胞组分 （CC）进行基因本体论（GO）功能富集分析；对基因通路进行基因组百科全书（KEGG）功能富集分析。

1.2.2 银屑病发病关键基因的筛选 将筛选出的银屑病高度相关DEG s 导入 STRING 数据库绘制蛋白质互作网络，置信分数设置为>0.4。并通过 Cytoscape 的 CytoHubba 插件，利用 MCC、DEGREE、EPC和 CLOSENESS 四种 Hub 基因算法，将四种算法结果的前10 个基因取交集，得到银屑病发病关键基因。选取外部银屑病基因芯片作为验证集，对筛选出的银屑病发病关键基因的表达水平进行验证。

1.3 银屑病发病关键基因表达水平与皮损组织免疫浸润细胞比例的相关性分析 通过 CIBERSORT算法，按照P<0.05 的标准计算 22 种免疫细胞在所有样本中的占比情况，并进行可视化；对银屑病皮损组织样本与健康对照皮肤组织之间的免疫细胞进行差异分析，并通过箱线图进行可视化。将关键基因与免疫浸润细胞进行 Pearson 相关性分析。

1.4 对银屑病有治疗潜力的中药预测选 将银屑病“Psoriasis”输入Coremine medical医学本体信息检索平台（WWW.coremine.com/medical/）的检索框中，在搜索结果中点击右侧“基因”选项，分别选择上述步骤中得到的银屑病发病相关关键基因，同时点击网页左侧“drug”选项，结果出现很多与银屑病发病相关的中药名。最后基于P<0.05的检验水准，筛选出现频次最高的中药作为对银屑病有治疗潜力的中药。

2 结果

2.1 银屑病发病关键基因的获取结果 筛选出银屑病DEGs 1 181 个，其中上调基因 564 个，下调基因 617个。

GSEA 分析结果显示，银屑病DEGs 富集最明显的前 5 个的信号通路分别是MAPK 信号通路、NOTCH 信号通路、mTOR 信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、醛固酮调节钠重吸收。

WGCNA 分析结果显示，获得了 24 个共表达模块，其中与银屑病相关性最高为 darkolivegreen4 模块，这个模块共包含了 1 807 个基因。

最终共获得348 个银屑病高度相关DEGs。GO富集分析结果显示，在生物过程方面银屑病高度相关DEGs 主要富集在线粒体翻译延伸、线粒体翻译终止、对其他生物的反应、翻译终止、对外部生物刺激的反应；在分子功能方面主要富集在线粒体内膜、细胞器核糖体、线粒体核糖体、细胞器内膜、线粒体蛋白复合体；在细胞组分方面主要富集于核糖体的结构组成、内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、肽酶活性作用于l -氨基酸多肽等方面。KEGG 富集分析结果显示，银屑病高度相关DEGs 相关的富集通路有NF-κB 信号通路、Toll 样受体信号通路、细胞因子—细胞因子受体的相互作用、P53信号通路、IL-17信号通路等。

最终得到了PCNA、CXCL8、S100A9、CCNB1 四个银屑病发病关键基因。 选取 GSE2737 芯片作为验证集分析结果显示，在银屑病皮损组织和正常皮肤组织中，PCNA、CXCL8、S100A9、CCNB1 表达水平差异均有统计学意义（P<0.05），并且在银屑病患者组织样本中所有关键基因均明显上调（见图1）。

图1 GSE2737中银屑病皮损组织和健康皮肤组织中银屑病发病关键基因表达水平的小提琴图

2.2 银屑病发病关键基因与皮损组织免疫浸润细胞的相关性 银屑病患者皮损组织样本中，CD8+T细胞、辅助性T细胞、未活化的树突状细胞平均占比最高，免疫浸润最明显。活化的树突状细胞和中性粒细胞在银屑病皮损组织中明显增高，而幼稚B细胞、活化的NK细胞、单核细胞在银屑病皮损组织中出现不同程度减少。γ δ T细胞与活化的CD4记忆T细胞之间存在正相关（r=1.00）；中性粒细胞和活化的NK细胞之间存在负相关（r=-0.93）。 银屑病发病关键基因PCNA 和CCNB1与中性粒细胞和活化的树突状细胞均呈正相关（r分别为0.87、0.83，P均<0.05；r分别为0.86、0.85，P均<0.05），S100A9 和CXCL8 与单核细胞均呈负相关（r分别为-0.80、-0.78，P均<0.05）。

2.3 对银屑病有治疗潜力的中药 银屑病发病关键基因相对应的中药见表1，其中出现频次最高的中药为厚朴花、大黄。

表1 银屑病发病关键基因对应的中药

3 讨论

银屑病的特点是慢性鳞屑性丘疹斑块，其皮肤损害可泛发至全身，并与多种合并症相关，如心脏代谢疾病、脑卒中、慢性肾脏疾病、炎症性关节炎、抑郁和淋巴瘤等［7］。 银屑病病程长、反复发作，可降低患者的生活质量，造成社会和个人的沉重负担。

本研究从 CIBERSORT 算法着手，筛选银屑病发病关键基因，探究银屑病发病关键基因与免疫浸润细胞的关系，并对银屑病有治疗潜力的中药进行筛选。在对筛选出的348 个DEG s 进一步分析筛选后，最终得到PCNA、CXCL8、S100A9、CCNB1 这四个银屑病关键致病基因。PCNA 是一种与 DNA 复制、修复和细胞周期进程有关的代谢蛋白，在细胞增殖方面发挥重要作用［8］，反映银屑病表皮细胞的增殖分化异常情况，可作为评估银屑病进展的最关键基因之一。CXCL8 即IL-8，是一种重要的促炎因子［9］，参与银屑病的发病过程，因此成为银屑病的潜在治疗靶点［10］。它参与调控疾病角质形成细胞增殖、中性粒细胞浸润和血管生成等。在银屑病病变的角质形成细胞中能够发现CXCL8 受体的表达，CXCL8 可通过自分泌的形式来激活角质形成细胞，并产生和释放炎症介质，有助于中性粒细胞迁移到病变部位［11-12］。有研究表明，CXCL8 蛋白水平与 PASI 评分呈正相关，进一步提示CXCL8 可能与寻常型银屑病的病情严重程度存在紧密联系。CXCL8 可能参与着寻常型银屑病的发生与发展，未来可能作为预测银屑病严重程度的有效指标，可为寻常型银屑病的病情进展及临床诊断提供有用的参考价值。S100钙结合蛋白 A9 （S100A9） 主要在中性粒细胞、单核—巨噬细胞系以及病变的角质细胞中表达［13］。S100A9 和 S100A8 形成二聚体之后，能够结合靶蛋白、传递钙信号以及调节胞质中钙离子的浓度［14］，参与了细胞的增殖分化、炎症反应、细胞凋亡等过程。在银屑病易感位点PSORS4 附近发现了S100A8 以及S100A9基因［15］，在银屑病发病的早期阶段也观察到了它们的表达［16］。银屑病患者的S100A8/A9 血清水平升高，并且升高的S100A8/A9 血清水平与疾病活动有明显的相关性，表明这些S100 蛋白是银屑病的潜在致病因子［17］。银屑病的病理机制与角质形成细胞的细胞周期密切相关，其中CCNB1 是与细胞周期相关的基因，有研究［18］显示 CCNB1、CDC20 在银屑病的皮损部位高表达，进一步提示CCNB1 可能与寻常型银屑病的发生与发展存在紧密联系。总之，这些银屑病发病关键靶基因可能在调节角质细胞增殖分化、参与炎症反应、维持正常的皮肤屏障功能以及调节胞质中钙离子的浓度方面发挥着重要的作用。

从数据集的 GSEA 分析结果中可以看出，其信号通路主要富集在MAPK 通路、NOTCH 通路、mTOR通路、磷脂酰肌醇信号系统、醛固酮调节钠重吸收等。在银屑病发生发展过程中，MAPK 信号通路能与多种细胞因子相互影响，发生一系列复杂的免疫反应。由此可见，MAPK 信号通路有可能是银屑病发病的关键通路之一［19］。NOTCH/HES1 信号通路通过调控 mTORC1 信号通路，促进 IL-17A 的表达，在银屑病中发挥促炎作用。KEGG 富集分析显示多条通路与银屑病发病相关。其中，由于NF -κ B在银屑病的发病过程中过度活化［20］，其活性升高后促进角质形成细胞分泌大量的促炎因子，而抑制 NF-κ B保护银屑病角质形成细胞的作用［21］。Toll 样受体家族（TLRs）作为一种重要的模式识别受体（PRR），主要参与细胞固有免疫，识别病原体相关分子模式并诱导天然免疫应答。研究［22］表明银屑病的发病可能与 TLR9 有紧密关系。p38 MAPK 信号通路能参与以 IL-17 为主导的银屑病的发病机制。在人表皮细胞中，p38 MAPK 激活后能增加 IL-6、IL-23 的表达从而特异性促进 IL-17 的分泌［23］，而 IL-17A 又能反向激活 p38 MAPK 信号通路从而使 IL-1、IL-22、IL-6、TNF-α 表达增多［24-25］，IL-17F 可通过激活 p38 MAPK，使 IκBξ 表达量升高，而IκBξ 又是银屑病相关基因的关键调控因子［26］。Th17 细胞分泌 IL-17A以及 IL-17F，IL-17 信号通路的主要靶细胞是角质形成细胞、内皮细胞和固有免疫细胞，其下游趋化因子和组织重塑因子的上调，表明 IL-17 信号通路在银屑病的疾病进展中起到关键的作用。

通过 CIBERSORT 反卷积算法对皮损组织样本中 22 种免疫细胞进行免疫浸润分析。从结果可以看出，辅助性T 细胞、未活化的树突状细胞、CD8+T细胞占比最高，并且辅助性T细胞、未活化的树突状细胞在病例样本中也明显升高。多种免疫细胞在银屑病病例样本中占比升高，提示其在银屑病发病时的重要意义。树突状细胞作为免疫应答启动的关键细胞，它具有高效摄取、 加工处理和递呈抗原的功能。未成熟 DC 在炎症性疾病中数量极少，具有较强的迁移能力；成熟 DC 能有效激活初始 T 细胞，位于启动，调控以及维持免疫应答的中心环节［27-28］。银屑病的发病离不开免疫和炎症刺激，而外周血Th1/Th2 平衡失衡和相关信号通路被激活是推动银屑病发展的起始和扩大阶段的主要原因［29］。其中Th1 主要分泌 IL-2、 IFN-γ，参与机体的细胞免疫和炎症反应［30］；而Th2分泌 IL-4、IL-10，参与体液免疫，同时还可抑制炎症反应［31］。正常情况下，外周血Th1/Th2 的相对平衡发挥着免疫保护作用，而其失衡则会引起过度炎性反应［32］。免疫细胞相关性分析显示，γδT 细胞与活化的CD4 记忆T 细胞之间存在明显的正相关性，表明这两种免疫细胞的协同作用对银屑病发病有重要影响。记忆T细胞区别于初始T 细胞的重要特征是能够高效和快速地产生细胞因子，也是CD4+记忆T 细胞发挥抗感染作用的关键机制。对人类银屑病进行的研究表明，浆细胞样树突状细胞通过分泌 IFNα 促发银屑病，而 IFNα 可促使 γδT 细胞分泌 IFNγ 及银屑病相关生长因子 IGF-1。此外，γδT 细胞还能分泌 TNFα、IL-17A［33］等与银屑病发展相关的细胞因子及 IL-8、CCL3、CCL4、CCL5 等趋化炎症细胞到皮肤局部的炎症因子，γδT细胞可能在银屑病的疾病进展中起着关键的作用。由此可以推测，这两种免疫细胞的协同作用对银屑病发病可能有重要影响，可以对其开展相关实验研究进行验证。银屑病发病关键基因PCNA 和CCNB1与中性粒细胞和活化的树突状细胞均呈正相关性，S100A9 和CXCL8 与单核细胞均呈负相关性。提示银屑病发病关键基因与银屑病的免疫细胞浸润机制有关。

在中医上，银屑病属于中医“白疕”、“白壳疮”、“松皮癣”、“干癣”等范畴，其病因多与血瘀、血燥、血热、 风邪、湿毒等相关。中医治疗多以清热凉血解毒、养血滋阴润肤、理气活血化瘀、清热利湿通络等为法。Coremine Medical 是一个基于文献的高效、精准数据挖掘服务平台。运用AI自然语言处理技术，Coremine Medical 对数据库内的文献信息进行分析，实现不同信息关联程度的可视化展示，以协助生物医学研究者进行数据相关性预测。其适用于各种实验设计，包括以基因/蛋白，药物或表型为导向的相关预测以及实验结果的辅助验证。本研究将筛选出的关键基因映射至 Coremine Medical 在线数据库，得到了相对应的中药，其中出现频次最高的中药为厚朴花、大黄。厚朴花性味功用与厚朴大致相似，但是药性更为温和，能行气宣郁，化湿和胃，理膈宽脘，且无耗气伤阴之弊。大黄是常用的中药之一，其具有活血逐瘀、清热泻火、通便导泻等功效。另外，现代医学研究［34］显示，大黄具备抑制胰酶分泌、保护胃肠道黏膜、促进肠道正常蠕动等功效，可以减少腹痛、腹胀等症状持续时间，缓解临床症状。有研究［35］表明，大黄可能通过调节体内 NF-κ B 信号通路，抑制众多炎症因子的释放，减缓机体的炎症反应从而对银屑病病程进行干预，但是其具体作用机制仍待挖掘。虽然目前暂未发现有关厚朴花治疗银屑病的研究或实验，但本研究对治疗银屑病中药的筛选结果提示对厚朴花、大黄可以进行深入的临床研究。

综上，银屑病的4 个关键基因PCNA、CXCL8、S100A9、CCNB1 均与皮损组织免疫浸润细胞比例存在较强相关性；对银屑病具有治疗潜力的中药为厚朴花、大黄。本研究为银屑病发病机制和治疗用药的进一步研究提供了新的指导方向。