PLCL2基因多态性观察及其与大动脉粥样硬化型脑梗死发病关系分析

王晓蓓，谢孟岐，刘梽颍，吴勤奋，张明洋，杨新玲

1 新疆医科大学第二附属医院神经内科 新疆神经系统疾病研究重点实验室，乌鲁木齐 830063；2 新疆医科大学

缺血性脑卒中是由于脑血管动脉粥样硬化和脑血栓、脑栓塞等导致脑动脉狭窄或堵塞，引起脑血流减少，最终引发供血部位脑组织缺血、缺氧的急性脑功能障碍的疾病［1］。大动脉粥样硬化（LAA）型脑梗死是缺血性脑卒中常见的发病类型，病情严重，预后较差，约有3/4 患者不同程度丧失劳动力或生活不能自理，给社会及家庭造成沉重的经济负担［2］。LAA 型脑梗死是多种因素共同作用的结果，动脉粥样硬化是其主要病理过程，目前发病机制尚未完全明确［3］。磷脂酰肌醇特异的磷酸酯酶2（PLCL2）是一种蛋白质编码基因，可以增强γ-氨基丁酸的受体结合活性，参与B 细胞激活、γ-氨基丁酸信号通路和B 细胞受体信号通路的负调控［4-5］。PLCL2可间接引起CRP、IL-6 分泌水平升高，促进炎症反应并加速血管动脉粥样硬化，在 LAA 型脑梗死的发生发展中可能起作用［6］。既往研究发现，PLCL2基因多态性与心肌梗死、缺血性脑卒中、代谢综合征的发生有关系，但其与LAA 型脑梗死的关系仍未明确。本研究收集新疆地区LAA 型脑梗死患者及体检健康人群的血液样本分析PLCL2基因4个SNPs 位点（依据目的基因位点要有潜在功能，并且位于内含子、启动子、5'UTR 区域的标签位点，最后通过综合考虑SNP 位点所在的功能区、功能预测结合已有研究文献），即PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210 的基因多态性，并进一步探讨PLCL2基因多态性与LAA型脑梗死的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2021 年7 月—2022 年7 月就诊于新疆医科大学第二附属医院诊断为LAA 型脑梗死患者105 例（病例组），均符合脑梗死的诊断标准，均经临床、头部CT及头部MRI扫描证实，且经颈动脉B超 + 头颅磁共振血管造影、头 + 颈部CT血管造影或脑数字剪影血管造影等证实脑血管的主干或分支>50%以上的狭窄或闭塞，推测源于动脉硬化，在供血区内发生急性脑梗死，直径大于1.5 cm，TOAST 分型为 LAA 型；排除多脏器功能不全、风湿免疫性疾病、感染性疾病。病例组中男65 例、女40例，年龄 40~75（63.18 ± 12.97）岁；神经功能缺损评分（NIHSS评分） 4～40分，其中合并有吸烟史36例、饮酒史26 例、糖尿病史46例、高血压史86例。对照组为本院同一时期年龄、性别、族别与病例组相匹配体检健康人群103例， 排除脑血管病、风湿免疫性疾病以及近2 周内发生过炎性病变的人群，其中男52例、女51 例，年龄45~72（61.24 ± 11.04）岁，其中合并吸烟史23 例、饮酒史20 例、糖尿病史26 例、高血压史66 例。本研究获得新疆医科大学第二附属医院伦理委员会批准，受试者均对多态性位点基因型检测知情同意。

1.2 PLCL2 基因多态性分析 采集两组入院外周静脉血2.0 mL，以EDTA 抗凝，用磁珠法全血 DNA提取试剂盒 （中科拜尔）抽取DNA放置于–80 °C保存。基于飞行质谱的分型技术（massarray SNP）针对PLCL2 rs2014490、rs9824172 rs4685423、rs4618210 SNP 位点多态性进行分析，采用Agena 公司的Assay Designer4.0 软件进行多重SNP 位点的引物设计评估，引物序列见表1，由北京博淼生物科技有限公司设计。

表1 PLCL2基因多态性位点引物和PCR序列

PCR 扩增反应步骤：取1.5 mL EP 管中配制PCR master mix，并振荡低速离心；每个加样孔中加入4 μL PCR master mix，最后加入1 μL 模板DNA（20 ng/μL）混匀，1 000 r/min 离心1 min。PCR 循环：94 ℃ 5 min（1 个循环），94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（45 个循环），72 ℃ 3 min（1 个循环），4 ℃∝，在PCR 反应结束后，将PCR 产物用虾碱性磷酸酶 （SAP）处理，以去除体系中游离的dNTPs。在新1.5 mL EP 管中配制碱性磷酸酶处理反应液，将SAP mix 加入384 孔PCR 反应板，反应总体积为7 μL，其中PCR 产物5 μL，SAP mix 2 μL。瞬时离心后进行如下反应程序：37 ℃、20 min， 85 ℃、5 min，4 ℃∝，并将384 孔反应板放置于PCR 仪上进行单碱基延伸反应。待检测SNP基因型互补的单碱基延伸产物进行树脂纯化，树脂纯化后的延伸产物移至点样仪上进行质谱检测及数据输出。将点样后的SpectroCHIP 芯片使用MALDI-TOF 质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存并分析数据。

对病例组、对照组PLCL2 基因分布进行Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，采用频数计数法统计受检人 群 PLCL2 rs2014490、rs9824172 rs4685423、rs4618210 位点上的基因型频率；根据基因型频率推算等位基因频率，并将推算得到的等位基因频率与对照组基因频率的分布进行比较。

1.3 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验，若超过1/4 单元格的理论频数均<5，则采用Fisher's 精确概率法。基于遗传模型（共显性模型、显性模型、隐性模型、超显性模型），使用非条件 Logistics 回归模型分析PLCL2 基 因 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210位点多态性与疾病的关联，其关联强度以比值比（OR）及95%置信区间（CI） 表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Hardy-Weinberg 遗传平衡检验结果显示，PLCL2 rs2014490 位点GG、AG、AA 基因型在受检人群中的实际频数为52、97、56 例，计算得到3 种基因型 理 论 频 数 为53.32、102.24、49.22 例，PLCL2 rs2014490 位点上各基因型的实际频数和理论频数的分布差异无统计学意义（χ2=0.599，P=0.741>0.05）。PLCL2 rs9824172 位点GG、GT、TT基因型在受检人群中的实际频数为53、94、61 例，计算得到3种基因型理论频数为52、93.6、60.32 例，PLCL2 rs9824172 位点上各基因型的实际频数和理论频数的分布差异无统计学意义（χ2=0.008，P=0.996>0.05）。PLCL2 rs4685423位点AA、CA、CC基因型在研究对象中的实际频数为54、89、62 例，计算得到3种 基因型 理论频 数为47.97、102.34、55.43 例，PLCL2 rs4685423 位点上各基因型的实际频数和理论频数的分布差异无统计学意义（χ2=1.657，P=0.437>0.05）。PLCL2 rs4618210 位点AA、GA、GG基因型在研究对象中实际频数为39、94、66例，计算得到3 种基因型理论频数为36.80、97.55、64.66 例，PLCL2 rs4618210 位点上各基因型的实际频数和理论频数的分布差异无统计学意义（χ2=0.141，P=0.932>0.05） 。 说 明 PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210位点达到遗传平衡，本研究中选取的样本群体对LAA型脑梗死患者具有群体代表性。

2.1 两组PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210 基因型频率、等位基因频率比较 PLCL2 rs2014490位点基因型为GG、AG、AA，在病例组中占比分别为29.1%、42.7%、28.2%，对照组中分别为21.5%、52%、26.5%；病例组等位基因G、A 基因频率占比分别为50.5%、49.5%，对照组分别为47.5%、52.5%；两组基因型频率及等位基因频率比较，χ2分 别 为2.13、0.35，P均>0.05。 PLCL2 rs9824172位点基因型为GG、GT、TT，在病例组中占比分别为26.7%、40%、33.3%，对照组中分别为24.3%、50.5%、25.2%；病例组中等位基因G、T频率占比分别为46.7%、53.3%，对照组分别为49.5%、50.5%；两组基因型频率及等位基因频率比较，χ2值分别为2.54、0.34，P均>0.05。PLCL2 rs4685423 位点基因型为AA、CA、CC，在病例组中占比分别为28.8%、35.6%、35.6%，对照组中分别为23.8%、51.5%、24.7%；病例组等位基因A、C 频率占比分别为46.6%、53.4%，对照组分别为49.5%、50.5%；两组基因型频率及等位基因频率比较，χ2分别为5.48、0.34，P均>0.05。PLCL2 rs4618210位点基因型为AA、GA、GG，在病例组中占比分别为16.7%、49%、34.3%，对照组分别为22.68%、45.36%、31.96%；病例组等位基因A、G 频率占比分别为41.2%、58.8%，对照组分别为45.4%、54.6%；两组基因型频率及等位基因频率比较，χ2值分别为1.14、0.70，P均>0.05。

2.2 PLCL2 基因的 4 个 SNPs 与LAA 型脑梗死的关系 PLCL2 基因rs2014490 位点，A 是野生型基因、G 是突变型基因，共显性模型： GG vs.AA 和GT vs.AA；显性模型：AG + GG vs.AA，隐性模型：AA +AG vs.GG；超显性模型：AA + GG vs.AG。基于共显性模型、显性模型、隐性模型、超显性模型的分析结果显示，PLCL2 基因rs2014490 位点与LAA 型脑梗死发生风险无相关性（P均>0.05）。

PLCL2 基因rs9824172位点，T是野生型基因、G是突变型基因，共显性模型：GG vs.TT 和GT vs.TT；显性模型：GT + GG vs.TT；隐性模型：TT + TG vs.GG；超显性模型：TT + GG vs.TG。基于共显性模型、显性模型、隐性模型、超显性模型的分析结果显示，PLCL2 基因rs9824172 位点与LAA 型脑梗死发生风险无相关性（P均>0.05）。

PLCL2 基因rs4685423位点，C是野生型基因、A是突变型基因，共显性模型：AA vs.CC 和CA vs.CC；显性模型：CA + AA vs.CC；隐性模型：CC + CA vs.AA；超显性模型：CC + AA vs.AC。基于超显性模型的分析结果显示，PLCL2 基因rs4685423 位点与LAA 型脑梗死发生风险具有相关性（OR=0.52，95%CI0.30～0.91，P<0.05）；基于其他遗传模型的分析结果显示，rs4685423位点与LAA型脑梗死发生风险无相关性（P均>0.05）。

PLCL2 基因rs4618210位点，G是野生型基因、A是突变型基因，共显性模型：AA vs.GG 和GA vs.GG；显性模型：GA + AA vs.GG；隐性模型：GA +GG vs.AA；超显性模型：GG + AA vs.GA。基于共显性模型、显性模型、隐性模型、超显性模型的分析结果显示，PLCL2 基因rs4618210 位点与LAA 型脑梗死发生风险无相关性（P均>0.05）。

3 讨论

LAA 型脑梗死是多个基因与环境因素共同作用的复杂疾病，越来越多的研究表明，危险因素与基因多态性的交互作用对疾病的发生具有协同效应［7-10］。SNP分析已经被广泛用于筛查脑梗死疾病易感基因位点。近年发现许多脑梗死的易感基因，如ZNF260 基因 rs34550124 多态性可能影响缺血性脑卒发生过程，并可能通过影响缺血性脑卒中患者的血压、血糖及凝血功能而导致临床症状不同［11］。LPL rs264 位点基因多态性可能与老年高血压患者LAA型脑梗死的发病相关［12］。PLCL2基因是一种新的磷脂酶C样蛋白，位于染色体3p24.3上，缺乏磷脂酶催化活性，是B细胞受体信号转导和免疫应答的负调控因子［6，13］，可能在免疫系统中发挥重要作用，参与的疾病有急性心肌梗死、急性脑梗死、代谢综合征、类风湿关节炎、新型冠状病毒肺炎，并与中国人群COVID-19严重程度密切相关［14-15］。PLCL2缺陷小鼠的实验数据表明，PLCL2是B细胞受体信号传导和免疫应答的负调节剂，被证明间接调节成熟B细胞，从而通过FAS介导细胞凋亡，影响免疫炎症应答。PLCL2基因可使免疫系统失调，促进血管动脉粥样硬化，参与心肌梗死的慢性炎症过程。

一项全基因组关联研究［5］发现，PLCL2 是日本人心肌梗死的新易感基因。后来有伊朗的一项病例对照研究［4］发现，PLCL2，从而基因中的rs4618210 A>G 多态性有助于心肌梗死的病因学诊断。本研究发现，PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210基因型频率、等位基因频率在两组间比较差异无统计学意义，PLCL2 基因多态性位点与疾病发生的结论不一致，考虑与LAA 型脑梗死的发生是个复杂的过程，是环境和基因相互作用的结果有关。HUANG 等［8］研究发现，PLCL2 基因rs4685423和rs4618210 SNP 可能与中国汉族人LAA 型脑梗死的危险性有关。SNP-SNP 相互作用分析显示，rs4685423 是LAA 卒 中 风险影 响因素［8］。与 携带PLCL2 rs4685423 位点CC 基因型人群相比，携带AA基因型、CA 基因型的人群LAA 卒中发生风险降低。本研究结果发现，PLCL2 rs4685423 位点携带纯合子（CC + AA 型）人群与携带杂合子（CA）人群相比患LAA 型脑梗死的可能性大。本研究与前人的研究中均发现PLCL2 rs4685423 位点CA 杂合子型患LAA 型脑梗死风险较其余基因型小，但是AA 纯合子型研究结果不一致，考虑可能与不同人群遗传因素和生活环境不同导致的遗传表型发生变化有关。 HUANG 等［6，8］研 究 发 现，与 携 带PLCL2 rs 4618210 位点GG 基因型人群相比，携带AA 基因型、GA 基因型人群LAA 卒中的发病风险降低。本研究发现，基于共显性模型、显性模型、隐性模型、超显性模型的分析结果显示，PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4618210 位点与LAA 型脑梗死发病风险不存在统计学意义上的关联，与文献研究结果不一致，未来需进一步扩大样本量再次验证。

总之， LAA 型脑梗死及正常健康人群PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210 位点均以突变杂合子所占比例为最多。携带PLCL2 rs4685423 位点纯合子（CC + AA 型）人群与携带杂合子（CA）人群相比患LAA 型脑梗死的可能性大。本研究也有一定的局限性，如研究对象均为新疆地区人群，由于遗传影响与种族背景密切相关，可能不符合其他种族；研究样本量小，对混杂因素调整不充分；采用了病例—对照研究设计，只能揭示相关因素与LAA 型缺血性脑卒中之间的潜在关联，而无法确定因果关系。