转染IGF2BP3基因siRNA和真核表达质粒的神经母细胞瘤细胞侵袭凋亡变化观察

朱凯，王志茹，高婷婷，吕志宝

1 上海市儿童医院 上海交通大学医学院附属儿童医院普外科，上海 200062；2 中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）儿外科

神经母细胞瘤（NB）是一种起源于神经外胚层神经嵴交感神经细胞的胚胎性肿瘤，是儿童最常见的实体性颅外恶性肿瘤，也是婴儿期最常见的肿瘤［1］。大多数患者（90%）在5岁前确诊，诊断时的中位年龄为19个月［2］。目前临床上依据儿童肿瘤协作组（COG）分级系统将NB 患者分为低危、中危、高危3组［3］，针对不同亚组患者建议采取不同强度的治疗模式。NB具有极强的异质性，不同亚组患者之间治愈的可能性差异很大。低中危组患者的生存率大于70%，高危组患者尽管采用多种治疗模式包括强剂量的化疗和免疫治疗，5 年生存率依然停留在25%～50%［4-5］。故探讨新的NB 治疗靶点，并对患者及早进行针对性干预，有助于改善NB患者的预后。

胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白家族（IGF2BPs）是一类包含两个N 端RNA 识别基序（RRM）和四个C端信使核糖核蛋白K同源性结构域的RNA 结合蛋白［6］。目前发现IGFBPs 蛋白在很多部位的肿瘤组织中存在高表达［7-9］；胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白3（IGF2BP3）可通过结合编码区不稳定性决定因子（CRD）防止MYC mRNA 降解，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移［10］。目前仍无相关研究报道IGF2BP3 在NB 中的作用。2022 年1 月—2023 年3 月，我们观察了转染IGF2BP3 基因siRNA和真核表达质粒的神经母细胞瘤（NB）细胞侵袭凋亡变化，以探讨IGF2BP3基因对NB细胞侵袭和凋亡的影响，为IGF2BP3作为阻断NB进展的潜在靶点提供研究资料。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器 NB 细胞株SK-N-BE（2）、IMR-32、BE（2）-C、SH-SY-5Y 均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；胰酶、RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国HyClone 公司；针对IGF2BP3 的小干扰RNA（siRNA）及对照（SiNC），IGF2BP3 真核表达质粒（IGF2BP3）及对照（Vector）均购自上海吉凯基因化学技术有限公司；Prime-Script™ RT Master 和MixRNAiso Plus 购自日本TAKARA 公司；HRP 标记山羊抗兔IgG、AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒、蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；PVDF 膜和细胞裂解液（Cell Lysis Solution）购自美国Millipore公司；ECL发光液购自美国Thermo 公司；IGF2BP3、E-cadherin、N-cadherin、vimentin 和GAPDH 抗体购自英国Abcam 公司；Matrigel 基质胶购自美国BD 公司；Real Time PCR 仪购自美国Applied Biosystems 公司；荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；实验所用引物委托上海生工生物工程公司合成。

1.2 4 种NB 细胞株中IGF2BP3 mRNA 及蛋白的检测及实验细胞选择 SK-N-BE（2）、IMR-32、BE（2）-C、SH-SY-5Y细胞均使用含有10% FBS及1×105U/L青霉素 + 100 mg/L 链霉素的RPMI-1640 培养基，在37 ℃含5% CO2的恒温培养箱中培养。所有细胞系经STR 谱鉴定，支原体试验阴性。采用qRT-PCR 法检测IGF2BP3 mRNA。PCR 反应在ABI Step One Plus 系统上进行，反应条件：预变性阶段 95 ℃持续10 min；扩增阶段95 ℃持续10 s、60 ℃持续15 s、72 ℃持续15 s，共经历45 个周期循环；溶解曲线阶段95 ℃持续10 s、65 ℃持续60 s 、97 ℃持续1 s。以GAPDH 为内参，2-ΔΔCT法计算IGF2BP3 mRNA在各组细胞中的相对表达量。扩增使用的引物分别为：IGF2BP3： forward：5'-ATCGCCAATCAGGAATCCTTTG-3，reverse：5'-CACAACACGTTCGTCCTCCA-3'；GAPDH： forward： 5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'，reverse： 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。结果显示，SK-N-BE（2）、IMR-32、BE（2）-C、SH-SY-5Y 细胞中IGF2BP3 mRNA 的相对表达量分别是8.35 ± 0.87、1.37 ± 0.06、2.73 ± 0.48、4.01 ± 0.36，4 株细胞的IGF2BP3 mRNA 相对表达量比较，P<0.01。SK-NBE（2）细胞IGF2BP3 mRNA 相对表达量最高，IMR-32细胞IGF2BP3 mRNA相对表达量最低。

采用Western blotting 法检测IGF2BP3 蛋白。根据目的蛋白和内参蛋白条带的显色结果，判断IGF2BP3 蛋白在NB 细胞中的表达水平。结果显示SK-N-BE（2）、IMR-32、 BE（2）-C、SH-SY-5Y 细 胞IGF2BP3 蛋白表达水平分别为1.24 ± 0.52、0.29 ±0.14、0.75 ± 0.26、0.68 ± 0.27，IGF2BP3 蛋白表达水平在SK-N-BE（2）细胞中最高，在IMR-32 细胞中最低。

采用Transwell实验观察4种NB 细胞侵袭情况。收集上述4 种细胞，用胰酶消化后用不含血清的培养基稀释细胞，按照10 000 个/孔接种至覆盖Matrigel 基质胶的24 孔的Transwell 小室膜上方，在下方加入含10% FBS的培养基，继续培养各组细胞48 h；接下来用结晶紫染液固定NB 细胞，待自然晾干后在200×倒置显微镜下观察染色细胞；随机选取至少3 个视野，拍照，计数，取均值。结果显示SK-N-BE（2）、IMR-32、BE（2）-C、SH-SY-5Y 细胞的穿膜细胞数分别是（200 ± 15）、（27 ± 3）、（48 ± 5）、（89 ± 8）个/HP，4 组NB 细胞穿膜细胞数差异有统计学意义（P<0.01），SK-N-BE（2）细胞穿膜细胞数最多、IMR-32细胞穿膜细胞数最少。

基于上述实验结果，选择后续实验细胞为SKN-BE（2）细胞、IMR-32细胞。

1.3 实验细胞分组及干扰和过表达IGF2BP3 质粒的转染 选择SK-N-BE（2）细胞转染针对IGF2BP3基因的小干扰RNA（siRNA）（SK-siIGF2BP3 组），并设立细胞对照组（SK-Control 组，只含有脂质体）和siRNA 对照组（SK-siNC 组，转染阴性对照序列）；选择IMR-32 细胞转染IGF2BP3 真核表达质粒（IMRIGF2BP3组），并设立细胞对照组（IMR-Control组，只含有脂质体）和空载体对照组（IMR-Vector 组，转染空载体）。siRNA 和过表达IGF2BP3 的质粒转染参照脂质体Lipofectamine 2000 说明书进行。将1×106个NB 细胞接种至6 孔培养板，待细胞汇合度达到70%～80%时，将脂质体和siRNA 用不含血清和抗生素和RPMI1640 培养基稀释，室温条件下孵育5 min 后将上述两者混合，反复吹吸数次，室温静置20 min。将混合液加入6 孔培养板孔中，继续培养6 h，弃去培养基，加入新鲜的完全培养基后继续培养。

1.4 实验细胞中IGF2BP3 mRNA 及蛋白检测 采用qRT-PCR法检测各组IGF2BP3 mRNA。采用免疫荧光法检测各组IGF2BP3蛋白。

1.5 实验细胞侵袭能力观察 采用Transwell 法检测。

1.6 实验细胞凋亡率的测算 采用流式细胞术。收集上述各组细胞，细胞转染48 h 后用0.25%胰蛋白酶消化，1 000×g 离心5 min，弃上清，收集细胞，用预冷的PBS洗涤3次，1 000×g离心5 min，弃上清，在离心管中收集1～5×105个NB 细胞。加入100 μL 的1×Binding Buffer 重悬各组细胞后加入5 μL 的 Annexin V-FITC 和10 μL 的碘化丙啶（PI）染色液，轻轻混匀，在室温（20～25 ℃）条件下与各分组的NB 细胞避光孵育15 min；随后将1.5 mL 的离心管置于冰浴中，再加入400 μL预冷的PBS，所有NB细胞在1 h内上机检测，FlowJo 7.6.5 软件用于分析检测结果。每组NB 细胞进行3 复孔检测，横坐标为FITC，纵坐标为PI，绘制散点图，分析凋亡细胞的百分比。

1.7 各组IGF2BP3 及侵袭相关蛋白E-cadherin、Ncadherin、Vimentin 的 检 测 采用Western blotting法。最后根据目的蛋白和内参蛋白条带的显色结果，判断IGF2BP3、E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin蛋白在NB细胞中的表达水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量资料以±s表示，比较采 one-way ANOVA 检验，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞IGF2BP3 mRNA 及蛋白相对表达量比较 SK-N-BE（2）细胞和IMR-32 细胞中IGF2BP3的 表 达 见 图1。在SK-N-BE（2）细 胞 中，SK-si-IGF2BP3 组、SK-siNC 组、SK-Control 组 的IGF2BP 3 mRNA 相对表达量分别是0.24 ± 0.06、0.98 ±0.09、1 ± 0.16，三组比较，F=0.364，P<0.05；SK-si-IGF2BP3 组IGF2BP3 mRNA 相对表达量低于SKControl 组（t=20.37，P=0.018）和SK-siNC 组（t=18.11，P=0.003）。SK-siIGF2BP3 组、SK-siNC 组、SK-Control 组的IGF2BP3 蛋白相对表达量分别为1.02 ± 0.31、1.14 ± 0.28和0.37 ± 0.17，三组比较，F=7.59，P<0.05；SK-siIGF2BP3 组IGF2BP3 蛋白相对表达量低于SK-Control 组（t=3.18，P=0.033）和SK-siNC 组（t=4.07，P=0.015）。以上说明在SK-NBE（2）细胞中通过转染siIGF2BP3，IGF2BP3 的敲减效果满意。

图1 SK-N-BE（2）细胞和IMR-32细胞中IGF2BP3的表达（200×，细胞免疫荧光法）

在IMR-32 细胞中，IMR-IGF2BP3 组、IMR-Vector 组、IMR-Control 组的IGF2BP3 mRNA 相对表达量分别为10.44 ± 1.26、1.09 ± 0.02、1.01 ± 0.16，三组比较，F=1.24，P<0.05；IMR-IGF2BP3 组mRNA 相对表达量高于IMR-Control 组（t=12.89，P=0.005）和IMR-Vector 组（t=12.90，P=0.006）。IMR-IGF2BP3组、IMR-Vector 组、IMR-Control 组的IGF2BP3 蛋白相 对表 达量 分 别 为0.24 ± 0.11、0.31 ± 0.13 和0.92 ± 0.36，三 组 比 较，F=7.94，P<0.05；IMRIGF2BP3组IGF2BP3蛋白相对表达量高于IMR-Vector 组、IMR-Control 组（t分别为3.13、2.76，P均<0.05）。以上说明在IMR-32细胞中转染IGF2BP3质粒后IGF2BP3的过表达效果满意。

2.2 各组穿越Transwell 小室膜细胞数比较 SK-NBE（2）细胞和IMR-32细胞中三组穿膜细胞见图2。在SK-N-BE（2）细胞中，SK-siIGF2BP3组、SK-siNC组、SKControl组的穿越Transwell 小室膜细胞数分别是（70 ±8）、（255 ± 16）、（247 ± 13）个/HP，SK-siIGF2BP3组细胞的穿越Transwell 小室膜细胞数低于SK-Control组（P=0.002）和SK-siNC组（P=0.005）。在IMR-32 细胞中，IMR-IGF2BP3 组、IMR-Vector 组、IMR-Control组穿越Transwell 小室膜细胞数分别是（71 ± 9）、（35 ±3）、（31 ± 4）个/HP，IMR-IGF2BP3组细胞的穿越Transwell 小室膜细胞数高于IMR-Control组（P=0.029）和IMR-Vector组（P=0.027）。

图2 SK-N-BE（2）细胞和IMR-32细胞中三组穿膜细胞（200×，Transwell法）

2.3 各组细胞凋亡率比较 SK-N-BE（2）细胞中，SK-siIGF2BP3 组、SK-siNC 组、SK-Control 组细胞凋亡 率分别 为21.87% ± 0.92%、8.65% ± 1.04%、5.79% ± 0.33%，SK-siIGF2BP3 组细胞凋亡率高于SK-Control 组（P=0.001）和SK-siNC 组（P=0.006）。在IMR-32 细胞中，IMR-IGF2BP3 组、IMR-Vector 组、IMR-Control 组细胞凋亡率分别为5.65% ± 0.12%、6.74% ± 0.30%、7.72% ± 0.55%，IMR-IGF2BP3 组细胞凋亡率低于IMR-Control 组（P=0.03）和IMRVector组（P=0.024）。

2.4 各组E-cadherin、N-cadherin和Vimentin相对表达量比较 SK-N-BE（2）和IMR-32 细胞中3 组侵袭相关蛋白表达电泳图见图3。SK-N-BE（2）细胞中，SK-siIGF2BP3 组N-cadherin、Vimentin、E-cadherin 蛋白相对表达量分别为0.16 ± 0.06、0.15 ± 0.07、0.76 ± 0.27；SK-siNC 组N-cadherin、Vimentin、Ecadherin 蛋 白 相 对 表 达 量 分 别 为0.71 ± 0.25、0.74 ± 0.26、0.11 ± 0.10；SK-Control 组N-cadherin、Vimentin、E-cadherin 蛋白相对表达量分别为0.68 ±0.15、0.83 ± 0.31、0.13 ± 0.08。 在IMR-32 细胞中，IMR-IGF2BP3 组N-cadherin、Vimentin、E-cadherin 蛋白相对表达量分别为0.86 ± 0.26、0.97 ±0.33、0.14 ± 0.05，IMR-Vector 组N-cadherin、Vimentin、E-cadherin 蛋白相对表达量分别为0.19 ± 0.08、0.17 ± 0.13、0.87 ± 0.31，IMR-Control 组N-cadherin、Vimentin、E-cadherin 蛋白相对表达量分别为0.21 ± 0.11、0.19 ± 0.12、0.89 ± 0.32。在SK-N-BE（2）细胞中，与SK-siNC组及SK-Control组比较，SK-si-IGF2BP3组中N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量下降，E-cadherin 蛋白相对表达量上升；在IMR-32 细胞 中，与IMR-Vector 组、IMR-Control 组 比 较，IMR-IGF2BP3组N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量升高，E-cadherin的蛋白相对表达量下降。

图3 SK-N-BE（2）和IMR-32细胞中3组侵袭相关蛋白表达电泳图

3 讨论

RNA m6A 修饰最终是由m6A 结合蛋白readers识别，并决定目标RNA 分子的表达趋势，影响着下游一系列的分子、信号通路及生物学功能［11］。IGF2BPs 作为RNA 结合蛋白（RBP）的一种，是由IGF2BP1-3 组成［12］。近年研究［13］显示IGF2BP3 可以通过稳定发生甲基化的癌基因mRNA，促进肿瘤的发生发展。NB的重要特征是它的异质性，其治疗需要根据危险度分组制定整体的治疗方案［14］。IGF2BP3在调控肿瘤细胞生物学表型方面起重要作用。为了阐明IGF2BP3在NB细胞中发挥的具体作用，我们着重研究了IGF2BP3 在体外实验中所表现出的对NB细胞侵袭和凋亡的影响；另外我们还对IGF2BP3 与侵袭相关的分子标记物的关系做了相关的探索。

首先我们分析了不同NB 细胞株中IGF2BP3 的表达水平，发现在4 株NB 细胞中，IGF2BP3 mRNA和蛋白在SK-N-BE（2）细胞中相对表达量最高，在IMR-32 细胞的相对表达量最低。接着我们通过细胞侵袭实验发现，IGF2BP3 表达水平高的SK-N-BE（2）细胞侵袭力最强，而IGF2BP3 表达水平低的IMR-32 细胞侵袭力较弱。以上的实验结果提示，IGF2BP3 的IGF2BP3 表达水平与NB 细胞的侵袭能力相关，这与IGF2BP3 在某些成人肿瘤中的报道结果有相似的趋势。 IGF2BP3 表达水平上调，提高了结肠癌的侵袭能力，是结肠癌进展和预后不良的独立预测因子［15］；IGF2BP3 促进乳腺癌的肿瘤细胞转移，与患者不良预后有关［16］。接下来，在GF2BP3 表达水平高且体外侵袭能力强的SK-N-BE（2）细胞中通过设计的siRNA 下调了IGF2BP3 的表达；通过IGF2BP3 蛋白的细胞免疫荧光实验，我们非常直观地看到转染siIGF2BP3质粒后，IGF2BP3蛋白表达下降了；相反，在侵袭能力较弱的IMR-32 细胞中转染IGF2BP3的过表达质粒，通过细胞免疫荧光实验，我们看到IGF2BP3 蛋白表达提高了，说明干扰实验成功。接着，我们通过Transwell 实验和流式细胞术证实，敲减IGF2BP3表达后的SK-N-BE（2）细胞体外侵袭能力减弱，凋亡加速；过表达IGF2BP3 的IMR-32细胞侵袭能力提高，凋亡水平降低。既往亦有文献［17-18］报道，凋亡相关通路的关键分子受到IGF2BP3的调控，从而能够改变细胞凋亡的进程，影响肿瘤细胞的微环境。

上皮间质转化（EMT）是恶性肿瘤转移和侵袭的重要机制之一，使细胞获得移动性，能够向远处迁移扩散［19］。它的特点是N-cadherin 上调和E-cadherin下调，具体的过程受到复杂的信号通路网络和转录因子的调控［20］，NB同样也具有迁移、侵袭、转移等恶性肿瘤的重要特点。最后，我们通过Western blotting 实验证实，敲减IGF2BP3 表达后的SK-N-BE（2）细胞，侵袭相关的分子标记物N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量降低，E-cadherin 蛋白相对表达量增加；相反，在IMR-32 细胞中通过增加IGF2BP3 的表达，侵袭相关的分子标记物N-cadherin和Vimentin蛋白的相对表达量升高，E-cadherin 蛋白的相对表达量降低；以上实验结果进一步证明IGF2BP3在NB细胞的侵袭过程中发挥着重要作用。

MYCN 作为MYC 癌基因家族的成员，控制多种细胞生物学过程，在NB 的分化、增殖、存活、自我更新、代谢、转移和血管生成等过程中发挥着重要的调控作用［21］。大约25%的NB 患者会出现来自2p24的MYCN 癌基因扩增，它是一种公认的肿瘤侵袭标记物［22-23］。先前的研究已经发现，在MYC编码区的3'端存在一个长度约250个核苷酸的顺式作用元件，称为编码区不稳定决定簇（CRD），它能够被IGF2BPs识别并结合，并提高MYC mRNA的稳定性，维持肿瘤的高侵袭力［24］。我们推测，IGF2BP3可能是通过类似的识别并结合机制，促进NB细胞的侵袭。

总之，我们的研究首次报道了IGF2BP3 可以促进NB 细胞侵袭、抑制细胞凋亡， IGF2BP3 在NB 中发挥着癌基因的作用。进一步研究IGF2BP3在维持NB细胞恶性生物学表型中的作用机制，可能为高危NB的诊断和治疗提供新的潜在靶点。