不同浓度PM2.5 对小鼠肺泡II 型上皮细胞MLE-12 的损伤作用及SP-B表达影响

李本，彭倩，高永峰，肖瑶，陈纪涛，刘季芳

广州医科大学附属第五医院 广州市加速康复腹部外科重点实验室，广州 510700

近年，随着全球城市雾霾水平上升，空气污染对人类健康的影响正引起全球关注［1］。PM2.5是空气动力学粒径≤2.5 μm 的颗粒物［2］，成分复杂，其中包括多种致癌成分如重金属、多环芳烃（PAHs）、未燃烧或未完全燃烧的燃料等［3-4］。PM2.5的危害存在于多方面，其中在呼吸系统上，长期暴露于高浓度PM2.5环境的人群会增加5 至15 年内慢性肺部疾病的发病率和死亡率［5-6］。有研究表明，PM2.5对肺泡上皮细胞有明显毒性作用，能导致细胞结构改变、活性明显下降［7］。25～100 μg/mL PM2.5暴露显著增加了肺泡上皮细胞的ROS 水平，且呈剂量依赖性［8］。肺表面活性物质（PS）是由肺泡II 型上皮细胞合成并分泌的一种脂蛋白复合物，包括二棕榈酰卵磷脂（DPPC）和肺表面活性蛋白（SP）［9］。SP 包括SP-A、SP-B、SP-C 和SP-D，其中SP-B 主要功能为降低肺表面张力，从而防止肺泡坍塌［10］。小鼠体内实验发现，气管内滴注外源性SP-B 可改善内毒素所诱导的急性肺损伤［11］。体外研究还发现，高浓度PM1可引起肺泡上皮细胞氧化损伤和自噬，并抑制SP-B 和SP-C 的表达［12］。然而，关于PM2.5对SP-B 表达的影响目前尚未见报道。2021 年9 月—2022 年5 月，本研究观察了不同浓度PM2.5作用后正常小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12 形态、超微结构和增殖能力变化及SP-B 水平的变化，为PM2.5致肺泡上皮细胞损伤的潜在作用机制提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、PM2.5、试剂及仪器 肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12 细胞株购自中国上海科学院细胞库。PM2.5购自美国国家标准与技术研究所，胰蛋白酶购自美国Sigma 公司，DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，SP-B 抗体购自美国SANTA CRUZ 公司，GAPDH 抗体购自美国CST 公司，RNA 快速提取试剂盒购自美国ESscience 公司，qRT-PCR 试剂盒购自美国Takara公司，超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物科技公司，倒置光学显微镜购自美国OLYMPUS 公司，透射电子显微镜购自日本HITACHI 公司，凝胶成像系统、分光光度计购自美国Bio-Rad 公司，荧光定量PCR仪购自美国Invitrogen公司。

1.2 MLE-12 细胞培养、分组及PM2.5混悬液加入将MLE-12 细胞接种至含10%胎牛血清、1%青—链霉素的DMEM 完全培养基，置于37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养。待细胞贴壁生长至80%后，弃去培养基，PBS 洗2 遍加入胰酶消化至在显微镜下能观察到大部分贴壁细胞变圆并脱落，接着加入培养基终止消化并传代培养，取以对数生长的细胞用于实验。将细胞分为实验组和对照组，实验组分别用加入12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5混悬液的DMEM 完全培养基培养，PM2.5剂量选择的主要依据为课题组前期预实验的结果以及多径颗粒剂量法（MPPD）模型软件计算出的PM2.5环境暴露24 h后在气管—支气管上皮表面的沉积浓度［13-14］；对照组用DMEM完全培养基培养。

1.3 细胞形态及超微结构观察 将不同浓度PM2.5溶液处理的实验组和对照组细胞培养24 h 后，利用倒置显微镜观察细胞形态变化；不同浓度PM2.5溶液处理的实验组和对照组细胞培养24 h 后弃去培养液，使用0.25%胰酶消化细胞2 min，接着加入培养液转移至离心管以1 000 r/min 的转速离心5 min。离心完毕后弃去培养液，沿离心管壁缓慢加满电镜固定液。在4 ℃下固定15 min 后制片，采用透射电镜观察细胞超微结构变化。

1.4 细胞增殖能力观察 将对数生长期的实验组和对照组细胞按1×104/mL 接种至16 孔的细胞培养板中，在室温超净台内放置30 min，然后放入预先摆放于培养箱中的RTCA 分析仪上，进行实时动态的细胞增殖检测。次日弃掉原培养基，实验组依次加入含不同浓度PM2.5的DMEM 完全培养基，对照组仅加入DMEM 完全培养基，各组设置3个复孔。利用RTCA 分析仪记录细胞48 h 内的增殖曲线。

1.5 细胞SP-B 蛋白检测 采用Western blotting法。分别用加入0（对照）、12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5的培养基培养MLE-12细胞24 h，将细胞用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在冷RIPA 缓冲液中裂解，用BCA 检测试剂盒测蛋白浓度。蛋白质样品在99 ℃下进行10 min 的变性，下一步在12% SDSPAGE 凝胶上对蛋白进行分离，接着将其转移到PVDF 膜上。用50 mL 含5%脱脂奶粉的TBST 在室温下进行2 h 封闭，然后分别与GAPDH、SP-B 一抗（1∶1 000）4 ℃共同孵育过夜。用TBST 进行3 次洗涤，每次洗涤10 min，将其放置于室温下二抗孵育1 h 后，再次使用TBST 洗涤3 次，每次洗涤10 min，最后借助Image Lab 软件进行显影曝光。曝光结果利用Image J 软件分析条带灰度值，以SP-B 条带与GAPDH 条带灰度比值作为SP-B 蛋白的相对表达量。

1.6 细胞SP-B mRNA 检测 采用qRT-PCR 法。课题组前期应用转录组测序技术分析了0、25、100 μg/mL PM2.5对细胞化学致癌通路的影响，发现100 μg/mL PM2.5能减弱谷胱甘肽S-转移酶的解毒功能 而 影 响 化 学 致 癌 通 路［13］。 因 此 用0、25、100 μg/mL PM2.5的培养基培养MLE-12细胞24 h，按照RNA 快速提取试剂盒说明书分别进行RNA 的提取。依照PrimeScriptTMRT 试剂盒说明书合成cDNA。将引物稀释后，混匀TB Green Premix Ex TaqⅡ、PCR Forward Primer、PCR Reverse Primer、ROX Reference Dye II 和cDNA 配 成PCR 反 应 液，使 用qPCR 仪进行实时定量PCR 扩增，在PCR 系统上设置组别，实验参数：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，循环40 次。仪器运行结束后将结果以Excel 表格方式导出，以GAPDH 作为内参，根据2-ΔΔCt公式计算SP-B mRNA 的相对表达水平。引物序列：SFTPB上游为5'-CTATCACGTCGGCCTCATCC-3'，下游为3'-TGGCACAGGT-CATTAG-CTCC-5'；GAPDH 上游 为5'-GGTCCCAGCTTAGGTTCATCA-3'，下 游为3'-CCAATACGGCCAA-ATCCGTTC-5'。

1.7 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。服从正态分布且方差齐性的计量资料以±s表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PM2.5作用后MLE-12 细胞的形态、超微结构及增殖能力变化 ①各组MLE-12 细胞形态变化：对照组细胞生长状态良好；实验组中观察到随着PM2.5浓度的升高细胞逐渐变得皱缩呈扁圆型，部分细胞形态不规则、背景颜色加深，可见PM2.5颗粒和吸附了颗粒的细胞，见图1。②各组MLE-12 细胞超微结构变化：对照组细胞中观察到了正常的超微结构；实验组细胞中发现了自噬溶酶体，出现板层小体损伤、线粒体肿胀、线粒体嵴断裂甚至空泡化和内质网扩张等细胞器损伤现象，损伤的严重程度随着PM2.5浓度的升高而增加，见图2。③各组MLE-12细胞增殖能力变化：0、12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5作用24 h后细胞增 殖 指 数 分 别 为0.005 2、-0.022 9、-0.031 1、-0.042 0、-0.070 4、-0.106 5，呈明显的浓度效应关系（R2= 0.936 4）；作用48 h 后细胞增殖指数分别为-0.028 6、-0.050 6、-0.066 9、-0.069 7、-0.108 6、-0.156 8，呈明显的浓度效应关系（R2= 0.966 4）。其中200 μg/mL PM2.5作用后细胞抑制程度最显著，其细胞增殖指数没有上升期，一直呈下降趋势。

图1 光学显微镜下对照组及实验组MLE-12细胞形态

2.2 PM2.5作用后MLE-12 细胞SP-B 蛋白及mRNA相对表达量 0、12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5作用后，细胞SP-B 蛋白相对表达量分别为1、0.902 ± 0.136、0.819 ± 0.173、0.727 ± 0.191、0.602 ± 0.138、0.644 ± 0.112。与0 μg/mL PM2.5相比，12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5作用后细胞SP-B 蛋白相对表达量均降低，且具明显的浓度效应关系（R2= 0.637 4），其中50、100、200 μg/mL PM2.5作用后细胞SP-B 蛋白相对表达量降低差异有统计学意义（P均< 0.05）；0、25、100 μg/mL PM2.5作用后，细 胞SP-B mRNA 分 别 为1、0.623 ± 0.153、0.590 ± 0.087。 与0 μg/mL PM2.5相 比，25、100 μg/mL PM2.5作用后细胞SP-B mRNA 相对表达量均降低，且具明显的浓度效应关系（R2= 0.553 2，P均< 0.05），以100 μg/mL PM2.5作用后降低更为显著。

3 讨论

PM，又称为颗粒物，指空气中分散的固体、液体悬浮物或固液混合微粒，根据其在肺中的沉积部位可分为粗颗粒物（PM10）和细颗粒物（PM2.5）［15］。最新发布的2022 年世卫组织年度报告显示，PM2.5暴露对人类健康构成了巨大威胁［16-17］。据全球疾病负担研究估计，环境PM2.5是全球第五大最重要的死亡危险因素［18］，2017 年全球290 万人的死亡可归因于室外PM2.5污染［19］。先前的流行病学研究表明，PM2.5暴露与多种呼吸道疾病（如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺癌）之间的关系已得到证实［20］。PM2.5进入呼吸道后，其有毒成分能够引起肺组织炎症细胞浸润，增加炎症因子表达水平，诱导肺泡上皮细胞凋亡以及肺超微结构改变［21-22］。因此，我们有必要进一步探究PM2.5对机体的毒性作用。

肺泡Ⅱ型上皮细胞的正常功能对维持肺泡结构和功能及局部环境稳态具有重要作用，其功能状态的改变被认为与多种肺损伤及肺部疾病的发生有关［23］。本研究首次在12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5的染毒梯度下，采用光学显微镜观察正常肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12 形态，透射电镜观察细胞超微结构，RTCA 仪检测细胞增殖能力，发现PM2.5可呈剂量依赖性损伤细胞形态和超微结构、抑制其增殖，表明PM2.5对MLE-12细胞具有一定的毒性作用。我们课题组的前期研究结果还发现PM2.5可促进肺泡上皮细胞的迁移、侵袭、上皮间质转化和激活化学致癌通路相关基因，提示PM2.5能促进细胞恶性转化，有潜在的致癌作用。然而，PM2.5致毒性的分子机制目前尚未完全阐明。

SP 在肺泡Ⅱ型上皮细胞的内质网（ER）中合成并转运至高尔基体（GA），随后被分泌到肺泡表面发挥免疫防御和呼吸调控等作用［24］。PM2.5通过呼吸道到达肺泡表面并沉积，影响SP 的表达进而造成肺组织损伤， 引起呼吸系统疾病［25］。已有研究［8］证明高浓度PM2.5暴露下，显著降低了A549 细胞和Balb/c 小鼠SP-A 蛋白的表达。众所周知的是，SP-B 和SP-A 具有协同作用，执行宿主防御活动并调节表面活性剂的生物物理性质，二者的功能合作在维持正常肺功能方面起到重要的保护作用［10，26］。有研究［27］表明，敲除SP-B 基因的小鼠和SP-B 基因突变的新生儿生后均死于呼吸窘迫。另外，LIN 等［28］发现用SP-B 启动子驱动的CD59 特异性shRNA 包装的JC 多瘤病毒样颗粒能抑制人肺腺癌生长和转移。本课题组前期通过Gepia Cancer 和Kaplan-Meier Plotter 数据库分析发现SP-B 在肺癌组织中表达更低，且低表达SP-B 的肺癌患者生存期明显缩短，提示SP-B 的表达可能作为肺癌的一种肿瘤标志物。值得注意的是，目前关于PM2.5对SP-B 表达的影响及意义尚未见报道，所以我们在PM2.5诱导MLE-12 细胞损伤的实验基础上，采用Western blotting 和qRT-PCR 检测SP-B 的表达，结果显示PM2.5浓度越高，SP-B 蛋白及mRNA表达下降越明显，推测PM2.5致MLE-12 细胞损伤可能与SP-B 表达有关。

综上所述，PM2.5可导致MLE-12 细胞发生损伤，可呈剂量依赖性损伤细胞形态和超微结构、抑制细胞活性，且下调SP-B 的表达。然而，单纯检测MLE-12 细胞的SP-B 蛋白和mRNA 变化尚不能阐明PM2.5的毒性机制问题，需进一步实验比如观察PM2.5对过表达或敲低SP-B 的MLE-12 细胞的损伤作用，以探讨PM2.5的致毒机制，为PM2.5致肺损伤的治疗策略提供一定科学依据。