大口黑鲈形态特征、染色体核型及眼晶状体乳酸脱氢酶的电泳分析

张 涛,周剑光, 张 林,甘金华,何 力

(农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(武汉)/农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心/中国水产科学研究院 长江水产研究所,武汉 430223)

大口黑鲈(Micropterussalmoides)隶属鲈形目(Perciformes)、太阳鱼科(Centrarchidae)、黑鲈属(Micropterus),原产于北美洲,1983年从中国台湾引入广东省,是一种广温、生长迅速的优质淡水肉食性鱼类,已在中国多个省市推广养殖[1]。然而大口黑鲈在中国部分地区推广繁育过程中,普遍缺乏人工定向选育,且繁殖时未严格遵守亲本选择的要求,近期出现饵料转化率下降、生长速率减缓和病害频发等种质退化迹象[2]。另一方面,大口黑鲈可能存在杂交的现象[1],已有的研究表明,杂交产生的子一代在外形上一致[3],但种质已发生改变,表现出杂交优势,因此有必要加强大口黑鲈种质鉴定方面的相关研究。

目前关于大口黑鲈种质资源方面的报道主要集中在形态特征[3-7]、细胞遗传学[8-9]、生化遗传学[10-11]以及分子生物学[12-17]。通过形态水平的表型鉴定、同工酶电泳以及DNA分子标记都是鱼类种质鉴定的技术手段[18],对于亲缘关系较近的鱼类,如果仅借助一种种质鉴定技术未必能达到种质鉴定的目的,如大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种在胸、腹、臀鳍条、侧线上鳞和侧线下鳞等方面均无显著差异[19],有必要借助多种种质鉴定技术手段对大口黑鲈进行种质鉴定。从形态特征、核型分析和同工酶技术等多层面遗传学分析手段研究大口黑鲈种质的报道较少。本研究综合利用传统形态学分析、染色体核型分析和同工酶技术对大口黑鲈种质进行多层面遗传学鉴定分析,以期丰富大口黑鲈种质资源学的研究内容,为探讨种质鉴定在大口黑鲈良种选育中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大口黑鲈分别于2016年4月采自湖北荆州、2020年7月采自安徽合肥,共33尾,所有试验鱼均为纯种,来自国家级或省级良种场,不存在种质混杂现象,均为池塘养殖所得,随机选取,无伤、无畸形,体质量637.6～1 322.5 g,均值为(802.3±131.5) g,体长28.6～35.3 cm,均值为(30.3±1.4) cm。

1.2 试验方法

1.2.1 形态测定 在进行形态测量之前,所有试验鱼均停食1 d,按照“GB/T 18654.3-2008 养殖鱼类种质检验 第3部分:性状测定”中的方法规定,用游标卡尺(精确到0.01 mm)对33尾样本鱼进行测定。可数性状共7个,包括背鳍和臀鳍的鳍式、齿式、侧线鳞数、侧线上鳞数、侧线下鳞数以及左侧第一鳃弓外侧鳃耙数。可量性状共9个,包括全长(Total Length,TL)、体长(Standard Length,SL)、体高(Body Depth,BD)、头长(Head Length,HL)、吻长(Proboscis Length,PL)、眼径(Eye Diameter,ED)、眼间距(Eye Interval,EI)、尾柄长(Caudal Length,CL)和尾柄高(Caudal Depth,CD)。

1.2.2 染色体标本制备及核型分析 参照周剑光等[20]的方法进行染色体标本制备并进行核型分析。

1.2.3 同工酶制备、电泳方法及酶谱分析 参照“GB 21045-2007 大口黑鲈”中选取眼晶状体乳酸脱氢酶(LDH)作为鉴定大口黑鲈种质的生化遗传标记,同工酶制备、电泳方法及酶谱分析参照张涛等[21-22]的方法。

1.3 数据处理

所得数据采用Excel(2007)和SPSS 20.0(IBM公司,美国)进行分析,数据表示形式为“平均数±标准差”。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 形态特征及可数、可量性状

2.1.1 形态特征 观测33尾大口黑鲈(图1)外部形态,体纺锤形,侧扁,背稍厚。背部黑绿色,体侧青绿。体被小栉鳞。口裂大、斜裂,颌能伸缩,上颌骨向后延伸至眼后。眼球突出。吻端至尾鳍基部有排列成带状的黑斑。鳃盖上有3条呈放射状的黑斑。背鳍硬棘部和软鳍部间有一小缺刻;侧线完全,沿体侧中部与背鳍平行,后端几乎延伸至尾鳍基部。尾鳍略内凹、正尾状。第一鳃弓外鳃耙,形状似弯月形,除鳃耙背面外,其余三面均布满倒锯齿状骨质化突起。鳔一室,长圆柱形。上下颌均布满锥状细齿,较锐利。脊椎骨总数 30～32。腹膜白色。

图1 大口黑鲈外观形态Fig.1 Morphological measurement of M.salmoides

2.1.2 可量、可数性状 大口黑鲈可数、可量性状分别见表1和表2,表1为所测各指标的上下限和均值,反映了所测数据的集中程度。可数性状中侧线鳞数变幅最大。可量性状中主要以体长和头长为参照,反映吻长和眼间距等头部与头长的比例关系,也反映了体高、尾柄长和尾柄高等躯干部主要性状与体长的比例关系。表3反映可量性状之间的相关性分析。

表1 大口黑鲈的形态特征的可数性状Table 1 Countable parameter of M.salmoides

表2 大口黑鲈的形态特征的可量性状Table 2 Parameters ratio of M.salmoides body size

表3 大口黑鲈各表型性状间相关性分析Table 3 Correlation coefficients among morphometric traits of M.salmoides

2.2 眼晶状体乳酸脱氢酶的表达情况

大口黑鲈样本眼晶状体LDH同工酶表达结果一致,随机选取10尾,其电泳图谱如图2所示,将靠近阳极最近的一条带定义为LDH1,自阳极向阴极方向依次编号为LDH2、LDH3……,10尾大口黑鲈眼晶状体LDH同工酶共检测到5条LDH酶带, 由3个基因即LDHA、LDHB和LDHC编码, 靠近阳极的两条LDH酶带为同一个基因,即LDHC基因编码的两个等位基因,其余3条LDH酶带由LDHA和LDHB两个基因编码,自阳极向阴极依次对应C1C1、C2C2、B4、A2B2、A4,LDH4表达活性最强,LDH1和LDH2表达活性相对较弱。

1～10分别表示不同个体的酶谱

2.3 染色体核型分析

2.3.1 确定染色体众数 在油镜下通过Olympus IX 81 倒置荧光显微镜系统进行观察、拍照,选取清晰且分散良好的100个中期分裂相,并统计染色体数目(表4),根据众数确定大口黑鲈二倍体染色体数2n=46。

表4 大口黑鲈染色体众数Table 4 Chromosome numbers of M.salmoides

2.3.2 核型分析 选取5个数目完整、无重叠、分散良好、长度适中和着丝粒清楚的分裂相,通过photoshop CS2软件测量每一条染色体的长臂和短臂,数据取平均值。计算相对长度和臂比,并按 Levan 等[23]提出的标准进行配对、分类并排列核型(图3)。染色体类型统计见表5。染色体相对长度和臂比值的计算参照“GB/T 18654.12-2002, 养殖鱼类种质检验 第12部分:染色体组型分析”中的方法。大口黑鲈染色体核型根据其着丝点位置可分为3组:第1组有1对中部着丝点染色体(m),第2组有1对亚端部着丝点染色体(st),第3组有21对端部着丝点染色体(t)。大口黑鲈染色体核型公式2n=2m+2st+42t,臂数NF=48。未发现带有随体、次缢痕的染色体和异型性染色体。

表5 大口黑鲈核型参数Table 5 Karyotype parameter of M.salmoides

图3 大口黑鲈染色体中期分裂相及核型图Fig.3 Metaphase chromosomes and karyotype of M.salmoides

3 讨 论

3.1 大口黑鲈的形态特征比较

表型差异是鱼类生态适应性最直接的外在表现[24],研究鱼类表型特征信息不仅有助于种质鉴定,而且还能为良种选育提供参考依据[25]。在可量性状方面,本研究与“GB 21045-2007 大口黑鲈”、李武辉等[1]的研究结果基本吻合,与蔡磊等[4]的研究结果中大口黑鲈北方亚种基本吻合,但与大口黑鲈佛罗里达亚种在头长/眼间距上存在较大差异,两者关于头长/眼间距分别为 3.06～3.91和4.39～4.71,头长/眼间距反映鱼体眼眶上缘之间直线距离占头长的比例,综合本研究与蔡磊等[4]关于大口黑鲈可量性状的研究结果,初步判断本研究中样本属大口黑鲈北方亚种。

在可数性状方面的不同见表6,造成可数性状差异的原因除了与样本量大小有关外,还可能与样本的种属特性有关,20世纪80年代中国大陆引进大口黑鲈北方亚种,而在北美的天然水域存在两个亚种:北方亚种和佛罗里达亚种,这两个亚种在可数性状上存在差异[4]。Bailey等[26]的研究结果也表明大口黑鲈北方亚种的侧线鳞数和肋骨数分别为59～65、15,而大口黑鲈佛罗里达亚种的侧线鳞数和肋骨数分别为69～73、14。本研究中的样本来源于湖北荆州和安徽合肥,属北方亚种的可能性较大。本研究与蔡磊等[4]的研究结果存在差异,尤其体现在背鳍分支鳍条上。本研究关于可数性状的结果与种质标准“GB 21045-2007 大口黑鲈”中的数据吻合,尽管该种质标准中未标明其中形态特征适应于大口黑鲈北方亚种还是佛罗里达亚种、或者两者都囊括,但鉴于目前大口黑鲈北方亚种已成为国内重要的淡水养殖品种之一[4],同时20世纪80年代中国大陆引进的是大口黑鲈北方亚种,作为一个中国政府批准发布、在国内执行的大口黑鲈种质标准,推测该标准中形态特征适应于大口黑鲈北方亚种。综合可量性状和可数性状分析,本研究中样本鱼属于大口黑鲈北方亚种的可能性较大。至于本研究与蔡磊等[4]关于大口黑鲈北方亚种可数性状的研究结果存在差异,尚需进一步分析考证。

表6 大口黑鲈可数性状的比较Table 6 Comparations of countable parameters of M.salmoides

3.2 大口黑鲈核型的比较

小岛吉雄根据鱼类染色体数目及核型特点,将真骨鱼类划分为低位类、中位类和高位类3个演化类群,高位类群的染色体数目多集中在42～48范围内,以2n=48最多,m型染色体和sm型染色体少,st型染色体和t型染色体多,而且以t型染色体为主[27]。大口黑鲈符合高位类群核型特征,在进化上属于较原始核型或者由原始核型演化而来。梁述章等[28]的研究表明,核型为2n=48t的鲈形目海水鱼类占已报道符合原始核型鲈形目海水鱼类的55.6%,推测鲈形目海水鱼类核型的相对稳定与海洋为鱼类提供相对稳定的生活环境有关。大口黑鲈作为一种淡水且符合高位类群核型特征的鱼类,其染色体核型公式2n=2m+2st+42t,也说明了在进化过程中淡水鱼类核型不及海水鱼类稳定,可能与淡水鱼类生活环境没有海水鱼类生活环境稳定有关,与Zhang等[29]的研究吻合。推测大口黑鲈核型可能是由原始核型通过着丝点融合、罗伯逊移位等方式演化而来。

从表7可见,除了秦伟等[9]的研究结果外,本研究与“GB 21045 大口黑鲈”、胡红等[8]的研究结果在染色体数目及核型上都相同。与秦伟等[9]的研究结果存在差异的原因可能是试验方法如PHA、秋水仙素浓度及处理时间等不同所致,也可能是染色体存在变异、样本来源存在不同地理分布以及样本鱼性别不同导致染色体核型不同。在其他鱼类的研究中也见类似现象,如棘头梅童鱼(Collichthyslucidus)[28-29]、黄鳍刺虾虎鱼(Acanthogobiusflavimanus)[30]。说明在研究鱼类染色体尤其据此作为鉴定种质的依据时,应尽可能收集不同地理种群、验证不同性别的鱼类,并通过不同的试验方法综合确证染色体数目及核型特征。

表7 大口黑鲈染色体核型比较Table 7 Comparations of karyotypes of fish of M.salmoides

接近40%的鲈形目鱼类核型为典型的原始核型或者由原始核型演化而来[30],张大莉等[10]也认为大多数鲈形目鱼类核型相像,因此在对鲈形目鱼类进行种质鉴定时建议综合多种技术手段,除了借助染色体核型外,需要结合形态特征以及DNA分子标记等分子生物学技术。

3.3 大口黑鲈眼晶状体LDH同工酶的比较

同工酶是生物机体的天然标记,具有明显的种属、组织和发育阶段的特异性,可作为生理指标和遗传标志[31]。本研究中大口黑鲈眼晶状体LDH共由3个基因即LDHA、LDHB和LDHC编码,与Philipp等[11]的研究结果一致,该研究中发现LDHC基因主要在大口黑鲈眼和脑中表达,而LDHA和LDHB基因在骨骼肌、肝脏和眼等所有组织中均有表达。已有的研究[32-33]表明LDH是由LDHA、LDHB、LDHC3个基因编码的四聚体蛋白质,LDHA和LDHB基因在脊椎动物各组织器官中普遍表达,可聚合成A4、A3B1、A2B2、A1B3、B4共5种四聚体,但在部分脊椎动物中只表达A4、B4两种四聚体和A4、A2B2、B4 3种四聚体,本研究中LDHA和LDHB基因在大口黑鲈眼晶状体中只表达A4、A2B2、B4 3种四聚体。LDHC基因具有高度的组织特异性,对鱼类而言依据不同种类表达在不同组织中,在鳟鱼、绿色太阳鱼、黑鲈等鱼类中,主要表达于神经视网膜光接收细胞和脑组织,称为“眼带”;而在鳕科、鲤科和胭脂鱼科鱼类中,主要表达于肝组织,称为“肝带”[34]。本研究中大口黑鲈LDHC基因在眼晶状体中特异性表达,酶谱图上表现为靠近阳极高迁移率,属典型的“眼带”,与上述已有研究结果一致。

4 结 论

大口黑鲈鳍棘部与鳍条部相连,背鳍鳍式D.VIII～XI-11～14;臀鳍鳍式A.III～9～12。口裂大。背部黑绿色,体侧青绿。吻端至尾鳍基部有排列成带状的黑斑。左侧第一鳃弓外侧鳃耙数为6～7,鳔1室,脊椎骨总数30～32。综合可量性状和可数性状分析,本研究中样本鱼属于大口黑鲈北方亚种的可能性较大。

染色体数目2n=46,核型公式为2m+2st+42t,臂数NF=48,未发现带有随体、次缢痕的染色体和异型性染色体,大口黑鲈进化上符合高位类群核型特征。

眼晶状体中的LDH酶带条数为5条,观察到LDHA、LDHB和LDHC3个基因。

在对大口黑鲈进行种质鉴定时,建议采用多种种质鉴定技术系统化地考察与评价其种质 状况。