“水蛭-三七”药对干预IgA肾病的网络药理学作用机制分析

谢永祥,肖阳平,左金巾,张晨云,刘 鑫,史 伟

(1.广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023;2.广西中医药大学,广西 南宁 530001)

IgA肾病(IgAN)是一种在肾小球系膜区以IgA沉积为主的原发性肾小球疾病。在我国乃至全世界范围内,IgAN是最常见的原发性肾小球疾病,且其患病率存在明显的地理分布差异,在亚洲地区高于其他地区[1]。当前,对于多数IgAN患者的治疗手段主要集中在生活方式的干预及肾素-血管紧张素-醛固酮系统阻断剂的应用,皮质类固醇激素因其抗炎及免疫抑制作用也被用于治疗IgAN,但其风险收益比仍不确定[2]。故目前仍没有针对该疾病的特异性治疗方法。近年来,愈多的研究表明中医药的合理运用能有效防治IgAN。中医古籍中并无IgAN病名,但根据其临床症状和体征,在中医学角度可将其归于“肾风”“血尿”“水肿”“虚劳”等范畴,其具有起病隐匿、病情反复、迁延难愈的临床特点,中医观点认为IgAN以上特点使其易演变成血瘀证,因此,为改善此类患者预后,“从瘀论治”至关重要[3-4]。研究发现,活血化瘀类代表药水蛭能针对肾小球硬化、系膜细胞增殖、血液流变学改变等血瘀证现代病理学相关系数来治疗肾脏病[5-6],且药效肯定。肾病血瘀证患者常伴出血即血尿,因此具有活血与止血双重功效的三七也常用于此[7]。史伟教授在治疗IgAN血瘀证经验总结中强调:应适时合理选择虫类、活血止血药,并可通过药对这种配伍形式来发挥其协同增效或减毒等作用的独特优势,常用药对“水蛭-三七”则是代表,两者均在改善肾病患者预后、延缓肾功能进展的临床应用中疗效显著[8-10],但目前关于从细胞及分子水平来阐释两者联合作用于IgAN机制的研究较少,因此本研究欲通过网络药理学方法探究其中的分子机制。

1 数据库及软件

TCSMP(tcmsp-e.com)、TCMID(www.megabionet.org/tcmid)、SymMap(www.symmap.org)、FAF-Drugs4平台(fafdrugs4.rpbs.univ-paris-diderot.fr)、中国知网(www.cnki.net)、PubMed(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)、PubChem(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、Pharmmapper平台(www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)、Uniprot(www.uniprot.org)、GeneCadrs(www.genecards.org)、DisGeNET(www.disgenet.org/home)、OMIM(omim.org)、Venny 2.1.0在线作图工具(bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、STRING(cn.string-db.org)、DAVID(david.ncifcrf.1gov)、RSCB PDB数据库(www.rcsb.org)、Cytoscape 3.7.1软件、Autodock Vina软件、Pymol软件。

2 方 法

2.1中药活性成分筛选 本次研究运用TCSMP、TCMID、SymMap数据库检索水蛭、三七的活性成分,为严格筛选活性成分,利用FAF-Drugs4平台[11]、TCSMP平台评价成分的ADME(吸收、分布、代谢、排泄)参数,分别选取评价为“accept”、OB(口服生物利用度)≥30%且DL(类药性)≥0.18的成分。将不满足以上条件而被平台过滤掉的成分在中国知网、PubMed数据库中进行检索,选取其中具有潜在研究价值的成分列入后续分析对象。最后通过PubChem数据库获取所有活性成分的PubChem CID。

2.2中药潜在作用靶点的预测 首先在PubChem数据库下载中药各成分的二维结构,然后通过Pharmmapper平台[12]预测各成分的靶点,筛选出物种为“Homo sapiens”且Norm Fit Score≥0.8的靶点作为后续分析对象。然后将收集到的靶点通过Uniprot数据库规范命名,整理得到“水蛭-三七”成分作用靶点集。

2.3疾病靶点检索 在“GeneCadrs”“OMIM”“DisGeNET”数据库中以“iga nephropathy”为关键词进行检索,去除重复后通过Uniprot数据库以“Homo Sapiens”为条件进行筛选并规范命名,整理得到IgAN靶点集。

2.4网络图构建 将中药成分靶点集与疾病靶点集通过Venny 2.1.0作图工具取交集。获取两者交集靶点,随后使用Cytoscape 3.7.1软件构建“中药-成分-交集靶点-疾病”网络图,并使用其内置插件“Cyto NCA”作拓扑学分析。另外通过STRING数据库构建交集靶点PPI网络图,再利用Cytoscape 3.7.1软件对网络图作拓扑学分析,选取度值排在前5位的靶点进行后续分子对接模拟实验。

2.5GO和KEGG富集分析 利用DAVID数据库对交集基因进行GO和KEGG富集分析,其中GO分析包括生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组成(cellular component,CC)3个模块。结果以气泡图、柱状图形式展现。

2.6分子对接模拟验证 分别从PubChem数据库及RSCB PDB数据库下载上述网络图中度值较高的化合物及关键靶点的3D结构式,即可在Autodock Vina软件将化合物与关键靶点进行分子对接,最后,将对接结果在Pymol软件中进行可视化,以预测化合物与蛋白质靶点的结合模式及结合亲合力。

3 结 果

3.1中药活性成分筛选及其靶点预测 以评价为“accept”而获得的水蛭活性成分共19个,以OB≥30%且DL≥0.18为条件筛选获得三七活性成分共8个。另外,1个水蛭活性成分水蛭素(Hirudin)及3个三七活性成分人参皂苷 Rb1(Ginsenoside rb1)、人参皂苷Rg1(Ginsenoside rg1)、三七皂苷R1(Notoginsenoside R1)因分别不满足筛选条件即评价为“accept”、OB≥30%且DL≥0.18而被相应平台过滤。通过查阅文献[13-21]并研究后发现以上4种成分在人体能发挥生物学活性,具有一定研究价值。因此,将其一并纳入后续研究。故最终获得活性成分共31种,其中20种来自水蛭,11种来自三七。活性成分关键信息见表1。使用Pharmmapper平台预测获取化合物潜在靶点为:水蛭221个,三七73个;去除重复后共有217个靶点。

表1 “水蛭-三七”成分关键信息

3.2疾病靶点的筛选 通过疾病数据库对IgAN靶点进行检索,共获得492个靶点,其中99个来自“GeneCadrs”、383个来自“DisGeNET”、10个来自“OMIM”,去除重复后获得438个IgAN相关靶点。

3.3网络图的构建与分析 将217个活性化合物靶点与438个IgAN靶点取交集,获取交集靶点18个,见图1。将以上2种中药、31种化合物、18个交集靶点及1种疾病导入Cytoscape 3.7.1软件,构建“中药-化合物-交集靶点-疾病”网络图,见图2。图中包含52个节点,154条边。其中,中药节点2个,活性成分节点31个,交集靶点节点18个,疾病节点1个。根据拓扑学参数─度值(表示某个节点在网络中与其他节点相连接的线条数。度值愈大,则节点形状愈大,节点在网络中的重要性也愈加突出)对网络图进行分析发现:度值排在前3的水蛭及三七活性化合物分别为SZ18、SZ3、SZ2及SZ19(两者度值相同并列第3),SQ3、SQ6及SQ4(两者度值相同并列第2)、SQ5,由此推测以上8种化合物可能是“水蛭-三七”药对调控IgAN的关键成分,其详细拓扑学参数见表2。

图1 “水蛭、三七”成分靶点与IgA肾病靶点韦恩图

注:黄色和绿色节点分别代表中药:水蛭、三七;红色和紫色节点分别代表水蛭、三七的活性成分;浅蓝色节点代表中药活性化合物与疾病的交集靶点;深蓝色节点代表疾病。每条边代表中药与活性成分、活性成分与靶点、疾病与靶点间的相互作用关系

表2 关键成分拓扑学参数

将18个交集靶点导入STRING数据库,发现靶点FCAR因未与其他靶点产生相互作用而游离在网络图外,因此,将其剔除后续分析。最终在Cytoscape 3.7.1软件中得到含有17个交集靶点的PPI网络图,见图3。以表2中所涉及的拓扑学参数分析网络图后发现ALB、CASP3、EGFR、HGF、NOS3、REN蛋白处在核心位置(详细拓扑学参数见表3),提示以上蛋白可能是“水蛭-三七”药对调控IgAN的关键点,是两者之间相互作用的“桥梁”。

表3 核心靶点拓扑学参数

3.4GO功能注释和KEGG信号通路富集分析通过DAVID数据库对以上17个交集靶点进行GO与KEGG分析,两者结果均以P<0.05(表示具有统计学意义)为条件进行筛选,最终GO分析得到61个条目,分为3个模块,包括42个生物学过程(BP)条目,9个细胞组成(CC)条目,10个分子功能(MF)条目。KEGG分析则共得到47个条目。按照P值由小到大的顺序选取两者中主要条目进行可视化。GO富集结果见图4,其中不同颜色的条目代表不同类型富集结果,GO中3个模块各自的富集结果见气泡图5～7;KEGG富集结果见气泡图8。在气泡图中,Y轴为条目名称,X轴为基因富集比例(即富集到某条目的基因数/进行富集分析的总基因数),气泡颜色代表富集显著性,气泡大小则代表富集到该条目的基因数。BP分析(见图5)显示:交集靶点主要参与了凋亡过程的负向调控、脂多糖应答、脂多糖介导的信号通路等生物学过程。CC分析(见图6)表明:以上交集靶点主要在细胞外区域、膜小凹、细胞质、膜筏、粘着斑等细胞组分中发生作用。MF分析(见图7)提示:这些交集靶点主要涉及肠杆菌素结合、酶结合及活性、蛋白质结合等分子功能。KEGG分析(见图8)可以看到:交集靶点主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路及癌症等多种通路和疾病上。

图4 交集靶点的GO分析图

图8 交集靶点KEGG富集分析图

3.5分子对接模拟验证 将表2中的关键成分与表3中的核心靶点进行分子对接,两者对接得分以热图展示,见图9。以对接得分值 (docking score) 即结合能评价化合物与关键靶点之间的交互作用强度,当结合能<0时,则说明靶点与活性化合物成分之间可自发结合,且结合能愈小,两者结合愈趋稳定。一般认为,当结合能<-7 kcal/mol时,两者则具有强烈的结合活性。从图9中可知,所有关键成分与核心靶点均具有较强烈的结合活性。部分对接结果见图10,从图中可看出蛋白质与小分子之间的结合模式,其中蓝色为蛋白质受体,绿色为小分子配体,黄色虚线表示氢键即两者间所形成的相互作用力。

图9 关键成分与核心靶点分子对接得分结果热图

A:Enoxaparin-ALB;B:Beta-sitosterol-ALB;C:Beta-sitosterol-CASP3;D:Ginsenoside rh2-HGF;E:Ginsenoside rh2-NOS3;F:Hirudin-REN

4 讨 论

4.1“水蛭-三七”药对干预IgAN的关键成分分析 本研究发现,来自于水蛭的SZ18(Enoxaparin,低分子肝素)、SZ19(Hirudin,水蛭素)及来自于三七的SQ6(Ginsenoside rh2,人参皂苷rh2)、SQ4(beta-sitosterol,β-谷甾醇)在分子对接试验中与各核心靶点之间的结合能总体高于药物中的其他成分,因此,可预测以上成分在干预IgAN中将发挥主要作用。低分子肝素具有强大的抗凝作用,可改善血液黏稠度、抑制微血栓的形成,从而改善肾小球内凝血功能以减少肾血栓形成的风险;它还通过抗炎、修复损伤的内皮细胞、促进细胞外基质降解等机制减轻肾脏损伤[22-24]。以上研究表明低分子肝素在IgAN患者凝血功能障碍中的确切疗效。凝血酶可通过促进成纤维细胞前胶原的产生而影响组织纤维化的进展过程[25],而肾组织纤维化与IgAN进展密切相关,水蛭素现被认为是最有效的天然凝血酶抑制剂[26],因此可预测水蛭素能通过对凝血酶的抑制来防治肾纤维化,进而延缓IgAN的进展。人参皂苷rh2具有抗炎、抗氧化以及抑制纤维化等作用,可参与调控氧化应激、细胞凋亡及组织纤维化等信号通路[27-28]。

研究证实,人参皂苷rh2可通过抑制肾脏组织细胞凋亡及纤维化进而改善糖尿病肾病肾损伤[29]。β-谷甾醇可通过抗氧化及抗炎等作用减轻肾脏损伤[30],研究显示β-谷甾醇的抗氧化作用体现为抑制因脂质过氧化和氧化性组织损伤而造成的急性近端小管坏死[31],其肾脏保护作用则体现在阻止TNF-α和IL-6的积累所诱导的炎症反应[32]。综上,可预测“水蛭-三七”药对的关键成分通过调节凝血功能障碍、抑制肾纤维化、抗氧化应激以及抗炎症反应等方式干预IgAN。

4.2“水蛭-三七”药对干预IgAN的关键靶点分析 6个关键靶点:ALB、CASP3、EGFR、HGF、NOS3、REN,它们在PPI中具有重要位置(即相互作用程度高),且在分子对接试验中与各关键成分具有较高的结合活性。ALB对肾小管上皮细胞及足细胞具有毒性作用,可刺激炎性、血管活性及纤维化物质的产生,从而造成肾小管间质损伤和纤维化[33]。ALB还与足突细胞足突消失、氧化应激增加、TGF-β1上调等肾脏损害相关[34-35]。CASP3是一种负责执行细胞凋亡的代表性效应因子,被认为是细胞焦亡的中介物质[36-37]。诸多研究表明CASP3是肾功能不全的关键因素,因为CASP3信号通路的激活可促进肾脏细胞凋亡,而中断其表达则可显著抑制急性肾损伤(AKI)相关的微血管减少和肾纤维化[38-39]。EGFR通路已被证实为肾脏疾病的潜在治疗靶点,它的活化可促进肾小管细胞增殖、炎症细胞浸润并诱导肾纤维化,因此它与多囊肾病、糖尿病肾病等多种慢性肾脏疾病的发展密切关联[40-41]。HGF作用于多种类型的上皮细胞,可调节细胞生长、细胞运动和形态发生。HGF可加速受损器官的组织再生,被认为是器官再生的关键因子[42]。HGF同时也是一种内源性肾脏保护因子,对TGF-β1具有抑制作用,可延缓慢性肾纤维化的发展[43]。NOS3又称为eNOS,是肾脏血流动力学的一种有效调节剂,它具有抑制血小板聚集、血管炎症,激活内皮祖细胞等作用[44]。eNOS被证明在防止尿毒症血管钙化方面有重要作用,有研究也反映维持eNOS对于降低心血管疾病和慢性肾脏病进展风险的重要性[45]。REN是编码肾素的基因,它的突变可致肾素失衡如诱导TGF-β1的高表达来刺激PAI-1、纤连蛋白和Ⅰ型胶原的增加,从而在肾纤维化疾病中发挥作用,在机体所有器官中,其对肾脏的影响最大[46]。

4.3“水蛭-三七”药对干预IgAN关键信号通路分析 通过对交集靶点的富集分析发现:脂质和动脉粥样硬化相关信号通路、TNF信号通路及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路富集程度较高,可能是“水蛭-三七”药对干预IgAN的关键信号通路。脂质代谢紊乱及其介导的炎症和氧化应激被发现参与了CKD患者肾小球硬化和肾小管间质纤维化的进展[47],另外,脂质代谢紊乱还是动脉粥样硬化和心血管疾病(目前CKD患者死亡的主要原因)以及CKD患者许多其他并发症的主要驱动源之一[48],近来被认为是肾脏病进展的独立危险因素。而具有控制脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化作用的药物(如他汀类)被愈来愈多的证据支持可延缓CKD患者肾功能进展及改善预后[49]。TNF信号通路存在多种细胞内(如系膜细胞、肾小管上皮细胞和巨噬细胞),其产生的信号分子在促进肾小球炎症和纤维化中发挥重要作用[50]。研究显示,限制该通路中信号分子的作用可减轻肾脏炎症和纤维化,同时可减轻蛋白尿及控制高血压[51]。糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路的激活可导致其下游多种细胞内信号通路被启动,包括MAPK/ERK、JAK-STAT、NF-κB以及PI3K/Akt/mTOR,这些不同途径的共同终点是在肾脏中发动炎症和纤维化并在其中形成一个恶性循环,进而损伤肾脏。另一研究发现,AGE-RAGE信号通路被阻断的糖尿病小鼠其糖尿病肾病进展发生延迟且肾脏组织中炎症和纤维化介质的表达也有减少,对抗肾细胞凋亡的能力也有所增强;这一发现反映出该通路在糖尿病肾病发病机制中的重要作用[52]。

综上所述,本研究通过网络药理学及分子对接技术实现了关于“水蛭-三七”药对干预IgAN的潜在靶点和机制的初步预测,发现水蛭素、肝素、人参皂苷rh2及β-谷甾醇4个关键成分通过调控ALB、CASP3、EGFR、HGF、NOS3、REN共6个关键靶点以实现调节凝血功能,对抗氧化应激、炎症及肾纤维化等作用干预IgAN。这为“水蛭-三七”药对干预IgAN的实验研究及临床运用提供了一定的科学依据和研究方向。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。