大柴胡汤对结石性胆囊炎豚鼠胆囊动力的影响及其机制

马亦湘,周春宇,杨成城,张少辉,张 涛,钱嘉惠,王馨悦,郭彦每,安佳琳

(1.北京中医药大学,北京 100029;2.北京中医药大学东方医院,北京 100078)

结石性胆囊炎是由胆囊结石引起的胆囊急慢性炎症,常因肥胖、饮食、情绪等因素导致反复发作,临床上常表现为反复发作的右上腹疼痛不适,严重影响患者的生活质量[1]。现代研究认为,结石性胆囊炎的主要病理机制为胆囊结石导致胆囊管阻塞、扩张、水肿,胆汁淤积引起胆汁酸代谢途径障碍,胆固醇清除能力下降,引起炎症因子趋化,胆囊动力降低,胆囊炎性细胞浸润,进一步加重炎症反应[2-3]。中医将结石性胆囊炎归为“胆胀”“胁痛”“黄疸”范畴[4-5],多运用大柴胡汤疏肝理气、利胆消石。本实验旨在通过高脂饲料诱导建立结石性胆囊炎豚鼠模型,观察大柴胡汤对豚鼠血清炎症因子水平及胆囊动力的影响,探讨该方治疗结石性胆囊炎的作用机制,以期为临床应用提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 普通级健康成年雌性豚鼠40只,体重(300±40)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号:SCXK(京)2016-0011。动物饲养于斯贝福(北京)生物技术有限公司动物实验室(SPF级),室温条件(22±2)℃,相对湿度保持在50%～60%,光照保持正常昼夜节律,分笼饲养。本实验通过斯贝福(北京)生物技术有限公司动物伦理审批(20200524-01)。

1.2药物 消炎利胆片(广东万年青制药有限公司生产,国药准字Z44023159);大柴胡汤复方颗粒制剂(由柴胡15 g、大黄6 g、枳实12 g、黄芩9 g、姜半夏8 g、白芍12 g、生姜12 g、大枣12 g组成,北京医珍堂中医诊所有限公司生产),按70 kg成年人日有效剂量为89 g(1 271 mg/kg),参考《中药药理实验方法学》[6]中人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值,豚鼠灌胃剂量=人的每日剂量(1 271 mg/kg)×70 kg×0.031/400 g=6.9 g/kg,故400 g豚鼠的用药剂量为2.8 g/d,按照2 mL/g的标准稀释颗粒制剂,豚鼠的灌胃剂量为5.6 mL/d。

1.3试剂及致石饲料 通用型4%组织固定液、苏木素染液、豚鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α) ELISA检测试剂盒、豚鼠白细胞介素-1β(IL-1β) ELISA检测试剂盒、豚鼠胆囊收缩素(CCK) ELISA检测试剂盒、豚鼠小窝蛋白-3(Cav-3) ELISA检测试剂盒、切片石蜡,购自北京泰科美生物科技有限公司。综合参考文献[7-9]的造模方法,选取含1%酪蛋白、1.5%蔗糖、1%猪油、0.02%胆酸、0.05%胆固醇与普通饲料混合的致石饲料,购自北京欧北实验科技有限公司。

1.4实验方法 将40只豚鼠按照随机数字法分为正常组、模型组、消炎利胆片组、大柴胡汤组,每组10只。模型组、消炎利胆片组和大柴胡汤组豚鼠普通饲料适应性饲养7 d后,连续喂以高胆固醇致石饲料4周建立结石性胆囊炎模型。造模成功后,参考文献[10]方法,消炎利胆片组给予消炎利胆片0.25 g/kg灌胃,大柴胡汤组给予大柴胡汤2.8 g/d灌胃,正常组和模型组给予生理盐水灌胃,灌胃量均为5.6 mL/d,1次/d,连续灌胃4周,各组喂养的饲料与灌胃前相同。

1.5检测指标与方法

1.5.1豚鼠一般情况 造模成功后观察各组大鼠的精神状态、皮毛的光泽度、进食量、排便量、大便形态,分别在造模后的第1天、第7天、第14天、第21天、第28天测量每只大鼠的体重,计算体重变化率(体重变化率=本次测量体重/上次测量体重×100%)。

1.5.2血清学指标 末次灌胃后禁食12 h,称重,用10%水合氯醛0.2～0.3 g/kg麻醉豚鼠,打开腹腔,取腹主动脉血5 mL,在室温下静置2 h,4 ℃下3 000 r/min离心10 min,分离得到上层血清,按照ELISA检测试剂盒说明测定TNF-α、IL-1β、CCK、Cav-3水平。

1.5.3胆汁量 腹主动脉取血后,结扎胆囊管,行胆总管插管,收集胆汁共2 h,测量胆汁量。

1.5.4胆囊肌条收缩活性 收集胆汁后,完整切除豚鼠胆囊,于胆囊颈部离断。每枚胆囊沿纵轴制备长1 cm、宽5 mm肌条3条,连于张力换能器,1.0 g前负荷下没于(37±0.5)℃ Krebs液,待出现自发节律性收缩并稳定15 min后,记录机械收缩信号(胆囊收缩频率、胆囊收缩振幅)。

1.6统计学方法 所有获取的实验相关数据均使用SPSS 20统计软件分析。符合正态分布的数据采用One-Way ANOVA方法进行组间比较,多重比较采用LSD法;不符合正态分布的数据采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组豚鼠一般情况比较 豚鼠在造模后出现行动迟缓,皮毛暗淡易脱,弓背,扎堆,尿液色黄,大便稀溏;消炎利胆片组和大柴胡汤组豚鼠药物干预后排便排尿情况、日常活动、皮毛光泽度及精神情况均较模型组明显改善,体重明显增长,但未恢复到正常水平。造模后第7,14,21天,模型组豚鼠的体重增长率均明显低于正常组(P均<0.05),消炎利胆片组和大柴胡汤组豚鼠造模后第7天和大柴胡汤组豚鼠造模后第21天的体重增长率均明显高于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和结石性胆囊炎各组豚鼠各时间点体重变化率比较 %

2.2各组豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平比较 模型组豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明显高于正常组(P均<0.05)。消炎利胆片组和大柴胡汤组豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明显低于模型组(P均<0.05),但大柴胡汤组豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明显高于消炎利胆片组(P均<0.05)。见图1。

图1 正常组和结石性胆囊炎各组豚鼠血清IL-1β、TNF-α水平

2.3各组豚鼠血清CCK、Cav-3水平比较 与正常组比较,模型组豚鼠血清CCK水平明显降低,血清Cav-3水平明显升高,差异均有统计学意义(P均<0.05);与模型组比较,消炎利胆片组和大柴胡汤组豚鼠血清CCK水平均明显升高,血清Cav-3水平均明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.05);与消炎利胆片组比较,大柴胡汤组豚鼠血清CCK水平更高,血清Cav-3水平更低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2。

图2 正常组和结石性胆囊炎各组豚鼠血清CCK、Cav-3水平

2.4各组豚鼠胆汁量比较 模型组豚鼠的胆汁量明显少于正常组(P<0.05);消炎利胆片组和大柴胡汤组豚鼠的胆汁量均明显多于模型组(P均<0.05),且大柴胡汤组豚鼠的胆汁量明显多于消炎利胆片组(P<0.05)。见图3。

图3正常组和结石性胆囊炎各组豚鼠胆汁量

2.5各组豚鼠胆囊肌条收缩活性比较 与正常组比较,模型组豚鼠的胆囊收缩频率明显减慢(P<0.05),胆囊收缩振幅无明显变化(P>0.05);与模型组比较,消炎利胆片组和大柴胡汤组豚鼠的胆囊收缩频率均明显增快(P均<0.05),胆囊收缩振幅均无明显变化(P均>0.05);与消炎利胆片组比较,大柴胡汤组豚鼠的胆囊收缩频率更快(P<0.05),收缩振幅无明显变化(P>0.05)。见图4。

图4 正常组和结石性胆囊炎各组豚鼠胆囊肌条收缩活性

3 讨 论

中医认为结石性胆囊炎病位在肝胆,其病机多为饮食不节、情志不畅、湿热蕴结等导致肝胆疏泄不利,肝调达受阻,胆升发不畅[11],胆内精汁不能排出,聚集成石,阻滞胆道,不通则痛,发为胆胀、协痛[12-13]。结石阻遏胆道,胆液不循常道,发为黄疸。本着治病求本的中医思想,临床多运用大柴胡汤治疗。大柴胡汤是仲景《伤寒杂病论》和解少阳、内泻热结的代表方,方中君以柴胡解热疏肝,除少阳之邪气,臣以黄芩和解清热,柴胡、黄芩合用得以疏肝解郁、清热利湿;大黄逐瘀泻热,芍药柔肝缓急止痛,与枳实配伍可理气和血,使疏肝而不伤肝[14];半夏、生姜可调和脾胃,缓解恶心呕吐;诸药合用,共同发挥疏肝理气、利胆消石之功。现代药理学研究表明,柴胡中的柴胡皂苷a和d能够通过抑制炎症介质和内源性糖皮质激素的释放发挥抗炎作用,且柴胡皂苷b2能够通过干扰IKKβ和IκBα活化有效抑制脂多糖诱导的促炎介质的释放,从而阻止NF-κB的激活[15];黄芩苷可通过阻断NF-κB、TNF-α、IL-6等炎症信号通路发挥抗炎作用[16];大黄中所含的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素等蒽醌类化合物可双靶点(NF-κB和iNOS)抑制脂多糖刺激巨噬细胞产生的炎症反应[17];大柴胡汤中的槲皮素可以参与调控CCK的表达从而治疗结石性胆囊炎[18]。

目前研究认为,结石性胆囊炎因胆囊黏膜层受到淤积胆汁中胆汁酸刺激和胃肠道细菌移位或者门静脉菌血症等因素影响而出现炎症反应,引起炎性细胞浸润和胆囊运动障碍等病理改变,其中TNF-α、IL-1β等炎性因子在结石性胆囊炎的发生发展中起了关键作用[19]。TNF-α能增强血管内皮细胞对白细胞的黏附作用,使白细胞聚集于炎症反应部位[20];IL-1β可通过吸引中性粒细胞趋化浸润、细胞因子合成、细胞内颗粒释放等过程来推进和加剧急、慢性炎症反应[21]。TNF-α、IL-1β的活化可以激活NF-κB信号通路,从而引发炎症级联效应,致使机体内炎性反应扩大并弥散蔓延[22]。本实验结果显示,大柴胡汤组豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显低于模型组,表明大柴胡汤可以降低结石性胆囊炎豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平,调控炎症反应,减轻胆囊炎症。胆囊动力的变化与胆囊疾病密切相关。胆囊收缩运动功能异常,排空延迟,使得胆囊内过饱和胆固醇胆汁形成的胆固醇结晶不能被及时地排入肠道,聚集成石,这是胆石形成的动力学机制[23]。CCK为人体分泌的脑肠肽激素,能促进胆囊的收缩运动,促进胆汁排泄;当体内CCK水平降低时,胆囊运动受到抑制,胆汁排泄障碍,容易在胆囊内淤积形成胆囊结石[24]。Cav-3为胆囊平滑肌上的一种结构性蛋白质,可以抑制胆囊收缩素受体(CCK-AR)的表达,从而抑制胆囊运动,导致胆汁淤滞,促进胆固醇结晶析出、聚集,进而形成胆囊结石[25]。本实验结果显示,与模型组和消炎利胆片组比较,大柴胡汤组血清CCK水平明显升高,血清Cav-3水平明显降低,胆汁量和胆囊肌条的收缩频率明显增加,提示大柴胡汤可以促进结石性胆囊炎豚鼠胆囊收缩而发挥利胆功效,且其利胆功效明显优于消炎利胆片,分析其促进胆囊收缩运动作用可能与调节血清CCK、Cav-3的表达相关。

综上所述,炎症因子诱导趋化、胆囊收缩运动障碍在结石性胆囊炎的发生过程中扮演了重要角色;大柴胡汤可通过下调血清TNF-α、IL-1β水平发挥抗炎作用,通过上调血清CCK水平、下调血清Cav-3水平发挥利胆作用,从而减轻炎症反应,促进胆汁分泌和胆囊运动。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。