肾不藏志型不寐大鼠肾、心、脑等相关组织IL-6、TNF-α表达的差异研究

陈 旭,张星平,梁瑞宁,王凯凯,梁政亭,闫德祺,王 慧

(新疆医科大学第四临床医学院,新疆 乌鲁木齐 830099)

不寐属现代医学“失眠症”范畴,指尽管在睡眠环境舒适、睡眠机会充足情况下,仍频繁入睡困难或睡眠难以维持等导致患者对自身睡眠质量或时间不满足的一种疾病[1]。相关机制研究显示,白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平与失眠联系密切,失眠患者IL-6、TNF-α水平较健康人明显升高[2-3]。IL-6水平升高能缩短慢波睡眠时长,影响睡眠质量,导致失眠发生[4];TNF-α在调节睡眠-觉醒周期方面具有重要作用,随着失眠患者睡眠质量的提升,血清TNF-α水平可逐渐恢复至正常[5]。笔者团队在《内经》“五神脏”理论及历代名家论著启发下,确立不寐五脏病位的“中医不寐五神分型诊断法”[6],且发现以夜寐早寤为主要表现特征的肾不藏志型不寐患者,其多导睡眠图结构参数呈现出NREM期中N1、N2期较常人延长和REM期缩短的特征性变化[7]。本研究采用D-半乳糖联合对氯苯丙氨酸(PCPA)构建肾不藏志不寐大鼠模型,探寻睡眠相关因子IL-6、TNF-α在肾不藏志型不寐大鼠肾、脑、心、肝、脾、肺、大肠、膀胱组织中的表达差异。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 16只SPF级雄性SD大鼠,8周龄,体重(200±20)g,购自新疆医科大学实验动物中心,动物合格证号:SYXK(新)2018-0003。大鼠适应性饲养3 d,自由进食饮水,SPF级饲养环境:温度20～26 ℃,相对湿度40%～70%,空气洁净度7级,昼夜明暗交替12 h/12 h,最小换气次数≥15次/h。本动物实验经新疆医科大学实验动物伦理委员会审批后进行(审批编号:IACUC20190116-01)。

1.2主要试剂及仪器 Anti-IL-6 Antibody(AA0624512,博奥森),Anti-TNF-α Antibody(BJ07106495,博奥森),中性树胶(G8590,Solarbio),免疫组织化学染色兔二步法试剂盒(2241D0401,中杉金桥),DAB试剂盒(218191011,中杉金桥),抗原修复液(C1034,Solarbio),无水乙醇(20210901,天津致远),二甲苯(20200920,天津致远)。真空干燥箱(DZF-6090,上海一恒),电热恒温水浴锅(DZKW-S-4,北京永光明),轮转式石蜡切片机(RM2235,Leica),正置荧光生物显微镜(Eclipse Ni-U,Nikon),NIS-Elements D图像采集软件(V5.01,Nikon),Image J图像分析软件(V1.53,National Institutes of Health)。

1.3分组与造模方法 将16只大鼠随机分为不寐组与对照组,每组8只。不寐组大鼠制备肾不藏志不寐模型:先予以D-半乳糖120 mg/(kg·d)颈背部皮下注射,1次/d,连续42 d,然后予以PCPA 300 mg/(kg·d)腹腔注射,1次/d,连续3 d,共45 d;当大鼠多导睡眠图NREM期中N1、N2期较正常大鼠延长,REM期较正常大鼠缩短的特征时,表明肾不藏志型不寐模型制备成功。正常组大鼠同期同等饲养环境下给予等体积0.9%NaCl溶液行相应部位注射。

1.4各脏器组织中IL-6、TNF-α表达免疫组化检测 使用7%水合氯醛溶液(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,迅速取肝、心、脾、肺、肾、膀胱、大肠、脑组织,并先后行4%多聚甲醛冲洗固定、石蜡包埋及切片(厚度4 μm)。各组织石蜡切片经65 ℃、120 min烤片后依次行脱蜡、复水、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育、一抗(IL-6、TNF-α)孵育过夜、酶标山羊抗兔IgG聚合物孵育、DAB显色、苏木素复染、盐酸分化、氨水返蓝、脱水、透明及中性树胶封片。在显微镜下观察相关脏器组织切片,各个组织均随机观察5张切片,每张切片随机取3个视野,阴性细胞染色为蓝色,阳性细胞染色为棕褐色,应用Image J图像分析软件V1.53计算平均灰度值。

2 结 果

2.12组大鼠各脏器组织中IL-6表达情况比较不寐组大鼠肾、心、脑、肺、大肠组织中IL-6表达平均灰度值均明显高于正常组(P均<0.05),2组大鼠肝、脾、膀胱组织中IL-6表达平均灰度值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1及表1。

表1 正常组和不寐组大鼠各脏器组织中IL-6表达平均灰度值比较

图1 正常组和不寐组大鼠各脏器组织中IL-6表达情况(免疫组化染色,×400)

2.22组大鼠各脏器组织中TNF-α表达情况比较 不寐组大鼠肾、脑、肺、大肠组织中TNF-α表达平均灰度值均明显高于正常组(P均<0.05),2组大鼠肝、心、脾、膀胱组织中TNF-α表达平均灰度值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2及表2。

表2 正常组和不寐组大鼠各脏器组织中TNF-α表达平均灰度值比较

图2 正常组和不寐组大鼠各脏器组织中TNF-α表达情况(免疫组化染色,×400)

3 讨 论

不寐是一种睡眠难以启动或难以维持并伴有日间功能障碍的疾病,中国人群患病率约为15%,中老年患者占比约为35.9%[8-9]。长期不寐会增加罹患精神心理疾病概率,且严重影响患者认知力,是轻度认知功能障碍及痴呆发生的独立危险因素[10-11]。课题组前期提出的“中医不寐五神分型诊断法”[6]将不寐病分为5种,包括以梦绕纷纭为主诉的肝不藏魂型、以入寐维艰为主诉的心不藏神型、以睡前思虑纷纭为主诉的脾不藏意型、以睡眠轻浅易寤或频寤为主诉的肺不藏魄型、以夜寐早寤为主诉的肾不藏志型。以上5种类型的不寐患者其睡眠多导图结构参数间存在差异,且中医不寐五神分型与四诊辨证分型在五脏定位上具有一致性[12],表明中医不寐五神分型诊断法具有科学性及客观性。课题组研究认为肾不藏志型不寐的临床单一主症是夜寐早寤,其核心病机为肾志不入于舍,常见病因为肾脏虚损[13]。《难经》曰:“老人血气衰……故昼日不能精,夜不得寐,故知老人不得寐也。”冯兆张于《冯氏锦囊秘录》又言:“壮年肾阴强盛,则睡沉熟而长;老年阴气衰弱,则睡轻而短。”以上均表明老人失眠以肾虚志不入舍多见,这与不寐患者以中老年多见的流行病学特征[10]相吻合。

失眠的发生与IL-6、TNF-α等多种睡眠相关因子密切相关,TNF-α对睡眠有双向调节作用,低水平TNF-α可促进睡眠,若表达过高则导致失眠[5]。苏浩[14]研究发现,脂多糖能诱导失眠大鼠TLR4下游MyD88、NF-κB表达,启动肠道局部炎症反应,增加IL-6与TNF-α表达。Su等[15]研究报道,睡眠剥夺模型大鼠脑组织中IL-6、TNF-α水平较正常大鼠显著增高。本研究中发现肾不藏志型不寐大鼠大肠及脑组织中IL-6、TNF-α水平均较正常组升高,这与前人结论相一致。HPA轴是调控机体应激反应的重要神经内分泌系统,HPA轴功能亢进是引起失眠的重要因素[16],对大鼠进行睡眠剥夺后,其体内IL-6、TNF-α水平升高并激活HPA轴,给予相应药物干预后,IL-6、TNF-α水平降低,睡眠状况得以改善[17],这表明通过调控IL-6、TNF-α水平能抑制亢进的HPA轴功能,从而调节睡眠-觉醒周期,亦说明IL-6、TNF-α与失眠关系密切。长期慢性失眠是心血管事件发生的独立危险因素,也是亚临床心脏疾病的标志,失眠可导致机体神经内分泌功能紊乱、交感神经兴奋,刺激炎症基因表达,诱导IL-6的合成与释放,炎症反应可损伤血管内皮细胞,促进心血管疾病发生发展[18]。本研究中,肾不藏志型不寐大鼠心脏组织中IL-6表达水平较正常大鼠明显升高,这亦验证了前述研究。本实验研究还发现,肾不藏志型不寐大鼠肺、肾组织中IL-6、TNF-α表达水平均较正常大鼠升高,而肝、脾、膀胱组织中IL-6、TNF-α表达水平与正常大鼠比较未见明显差异,其具体机制有待于后续深入研究。

综上所述,肾不藏志型不寐大鼠肾、脑、肺、大肠组织中IL-6、TNF-α表达水平和心组织中IL-6表达水平均较正常大鼠升高,IL-6、TNF-α的特征性变化可能是肾不藏志型不寐的特征性变化之一。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。