温阳复元方对脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体铁死亡相关蛋白IRP1和FAM96A表达的影响

李丽琴,莫雪妮,袁 莉,陈 炜,秦红玲,胡跃强,姚 春

(1.广西中医药大学,广西 南宁 530012;2.广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530020)

缺血性中风是中风病中最常见的一种,约占所有中风病例的87%,其特点是血栓形成或栓塞导致血流突然减少,阻塞了供应大脑特定区域的脑血管[1],是世界上第三大死因,也是最常见的致残病因[2]。线粒体铁死亡是最近发现的一种非凋亡性细胞死亡形式,其特征在于铁过载,谷胱甘肽(GSH)消耗,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)失活以及脂质和氨基酸代谢失衡[3]。有研究报道,在脑缺血和脑缺血再灌注损伤的发生发展中,线粒体铁死亡既诱发又加重脑组织损伤[4]。因此靶向调控线粒体铁死亡通路可以为缺血性中风的治疗提供新的视角。现已发现铁离子负载的转铁蛋白与大多数体细胞表面的铁调节蛋白1(Iron regulatory protein1,IRP1)结合,并且在复合物内吞作用后进入细胞质[5];96序列相似家庭成员A(Family with sequence similarity 96 member A,FAM96A)是新近发现的细胞质基质铁硫蛋白质组装机制的成员和细胞铁稳态的调节剂[6]。在细胞铁充足的情况下,IRP1能够在FAM96A的帮助下转换成含有铁硫族的顺乌头酸酶[7-8],调控其表达可能会对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。既往研究证实,四逆汤能够提升机体谷胱甘肽过氧化物酶活力,减轻自由基损害和抑制脂质过氧化物反应的作用[9],而以四逆汤为底方的温阳复元方在治疗缺血性中风方面取得了较好的临床疗效[10],故推测温阳复元方可能通过抗氧化应激反应进而抑制线粒体铁死亡。本实验通过观察温阳复元方对线粒体铁死亡相关蛋白IRP1和FAM96A表达的影响,旨在阐明该方对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用机制,为其临床应用提供更多的、科学的理论依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 健康雄性SPF级SD大鼠84只,12月龄,体重(250±50)g,由广西中医药大学第一附属医院动物实验中心提供,生产许可证号:SCXK(湘)2019-0014。实验方案通过广西中医药大学动物伦理委员会批准(DW20211204-195)。

1.2药物 温阳复元方由白附片30 g、黄芪30 g、党参30 g、石菖蒲20 g、淫羊藿15 g、田三七15 g、干姜10 g、炙甘草6 g组成。补阳还五汤由黄芪60 g、桃仁15 g、红花6 g、地龙10 g、赤芍15 g、当归6 g、川芎15 g组成。以上药物均由广西中医药大学第一附属医院药剂科统一采购,要求同一批次(批号:20190701)、同一质量、同一产地。所有药物浸泡30 min,白附片先煎1 h,后加入其他药物,分2次煎煮;再大火浓缩至含原生药浓度1.0 g/mL的药液。根据成人(70 kg)与大鼠体表面积换算,确定温阳复元方和补阳还五汤大鼠灌胃剂量分别为14.04 g/kg和11.43 g/kg。

1.3主要试剂和仪器 MCAO线栓(河南平顶山豫顺生物科技有限公司,批号:2543);Trizol Reagent(美国Ambion公司,批号:284909),mRNA反转录试剂盒(上海新贝生物科技有限公司,批号:F2967);mRNA扩增试剂盒(上海新贝生物科技有限公司,批号:F2967);IRP1一抗(北京Solarbio公司,货号:K111307P,1∶2 000);FAM96A一抗(上海Affinity公司,货号:DF12272,1∶2 000);山羊抗兔HRP-IgG(北京Biosharp公司,货号:BL003A,1∶20 000);DEPC水、GAPDH抗体(北京Biosharp公司,货号分别是BL510A和BL0068);DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:ZLI-9017,ZLI-9018,ZLI-9019)。LightCycler 96型PCR仪(瑞士Roche公司);H-600型透射电镜(日本日立公司);M200PRO型多功能酶标仪(瑞士TECAN公司);Centrifuge 5418R型低温离心机(德国Eppendorf公司)。

1.4实验方法 将84只SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、温阳复元方组、补阳还五汤组,每组21只。脑缺血再灌注组、温阳复元方组、补阳还五汤组大鼠在Longa线栓法[11]的基础上加以改良制备右侧大脑中动脉栓塞模型,线栓插入大鼠右侧颈内动脉大约17 mm,2 h后拔出线栓实现缺血再灌注,大鼠清醒后用Zea-Longa 5级评分法进行神经功能缺损评分,评分1～3分且无蛛网膜下腔出血的大鼠证实造模成功。温阳复元方组、补阳还五汤组在制作缺血再灌注模型前30 min分别给予温阳复元方14.04 g/kg和补阳还五汤11.43 g/kg灌胃,术后大鼠清醒后1 h继续予以原方灌胃,每日上、下午各1次;脑缺血再灌注组造模后灌胃等体积的生理盐水;假手术组除线栓只插入颈内动脉9 mm外,其余的实验步骤同脑缺血再灌注组。

1.5检测指标及方法 再灌注12 h、24 h、3 d时对各组大鼠进行神经功能缺损评分,然后取各组大鼠脑组织,一部分液氮冷冻后通过RT-qPCR检测IRP1、FAM96A mRNA表达情况;一部分进行脱水和包埋,通过免疫组化检测缺血灶脑组织中IRP1、FAM96A蛋白表达情况。

1.5.1神经功能缺损评分评定方法 采用Zea-Longa 5级评分法对大鼠神经功能缺损情况进行评分。0分:神经功能正常;1分:提尾时左侧前肢不能完全伸展;2分:追尾现象;3分:行走时向左侧转圈;4分:无法自主行走,意识丧失。评分越高说明大鼠神经功能障碍越严重。

1.5.2缺血灶脑组织中IRP1、FAM96A mRNA表达检测方法 使用Trizol试剂提取大鼠总RNA,测定RNA 的浓度和纯度,37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s进行反转录,得到在RNA各个位置反转录效率均一的cDNA,最后进行扩增,过程如下:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,使用全自动实时荧光定量仪器进行PCR产物的检测。所用引物序列见表1。实验所得CT值采用2-ΔΔCT法计算分析。

表1 引物序列

1.5.3缺血灶脑组织中IRP1、FAM96A蛋白表达检测方法 石蜡切片4 μm,玻片65 ℃烘烤2 h后脱蜡,在二甲苯中浸泡4次,每次10 min,去除多余液体后,梯度乙醇复水后在蒸馏水中冲洗1 min,置于柠檬酸钠中高压高温修复5～10 min,后滴水冷却至常温,水洗3遍,免疫组化笔划圈,加入适量内源性过氧化物酶阻断剂,室温孵育10 min,PBS缓冲液洗3遍,每次3 min;加入一抗,4 ℃冰箱过夜,用自来水洗去一抗,PBS缓冲液冲洗;滴加适量的山羊抗兔HRP-IgG,盖上盖子防止挥发,室温孵育20 min后冲洗;加入新鲜配置的DAB显色液(1∶19)染色直到显浅黄色为止,苏木素染色30 s,梯度乙醇中脱水后,中性树胶封片,观察结果,光学显微镜拍照,采用Image J软件检测图片的阳性细胞面积,算出平均光密度值。

1.6统计学方法 使用SPSS 25.0软件进行统计学分析。多个样本间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较方差齐者用LSD检验,方差不齐者用Tamhane’sT2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠神经功能缺损评分比较 假手术组大鼠各时间点神经功能缺损评分均为0分,脑缺血再灌注组大鼠各时间点神经功能缺损评分均明显高于假手术组(P均<0.05);温阳复元方组大鼠神经功能缺损评分随再灌注时间延长逐渐降低,再灌注3 d时最低,与脑缺血再灌注组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);补阳还五汤组仅在再灌注12 h时神经功能缺损评分明显低于脑缺血再灌注组(P<0.05),再灌注24 h、3 d时与脑缺血再灌注组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);与补阳还五汤组比较,温阳复元方组再灌注3 d时神经功能缺损评分更低(P<0.05)。见图1。

A为假手术组;B为脑缺血再灌注组;C为温阳复元方组;D为补阳还五汤组

2.2各组大鼠缺血灶脑组织中IRP1、FAM96A mRNA相对表达量比较 脑缺血再灌注组再灌注12 h、24 h、3 d时IRP1、FAM96A mRNA相对表达量均明显高于同期假手术组(P均<0.05)。温阳复元方组IRP1、FAM96A mRNA相对表达量随再灌注时间延长逐渐降低,再灌注3 d时最低,与脑缺血再灌注组相应时间点比较差异均有统计学意义(P均<0.05),且再灌注3 d时IRP1 mRNA相对表达量和再灌注24 h、3 d时FAM96A mRNA相对表达量均明显低于同期补阳还五汤组(P均<0.05);补阳还五汤组IRP1、FAM96A mRNA相对表达量随再灌注时间延长逐渐升高,但再灌注12 h、24 h时均明显低于同期脑缺血再灌注组(P均<0.05),再灌注3 d时与脑缺血再灌注组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 假手术组和脑缺血再灌注各组大鼠脑组织中IRP1和FAM96A mRNA相对表达量比较

2.3各组大鼠 缺血灶脑组织中IRP1、FAM96A蛋白表达情况比较 脑缺血再灌注组再灌注12 h、24 h、3 d时IRP1、FAM96A蛋白表达平均光密度值均明显高于同期假手术组(P均<0.05)。温阳复元方组IRP1、FAM96A蛋白表达平均光密度值随再灌注时间延长逐渐降低,再灌注3 d时最低,与脑缺血再灌注组相应时间点比较差异均有统计学意义(P均<0.05),且再灌注24 h、3 d时IRP1、FAM96A 蛋白表达平均光密度值均明显低于同期补阳还五汤组(P均<0.05);补阳还五汤组IRP1、FAM96A蛋白表达平均光密度值随再灌注时间延长逐渐升高,但再灌注12 h、24 h时均明显低于同期脑缺血再灌注组(P均<0.05),再灌注3 d时与脑缺血再灌注组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3及图2、图3。

图2 假手术组和脑缺血再灌注各组大鼠脑组织中IRP1蛋白表达情况(免疫组化染色,×400)

图3 假手术组和 脑缺血再灌注各组大鼠脑组织中FAM96A 蛋白表达情况(免疫组化染色,×400)

表3 假手术组和脑缺血再灌注各组大鼠脑组织中IRP1和FAM96A平均光密度值比较

3 讨 论

目前,中医对于缺血性中风的治疗存在较多的观点,根据患者发病的病因病机,常用的治疗方法主要包括养阴熄风、清火平肝或益气活血、化瘀通络或泄热通腑、化痰开窍等[12]。受《内经》重阳思想和“火神派”思想的影响,并依据多年以来对缺血性中风的认识,胡跃强教授团队认为元阳亏虚为本病的病机根本,元阳亏虚,脏腑温煦功能失调,阴寒内生,导致寒凝血瘀;痰瘀阻滞又进一步阻遏阳气的化生,导致肝风夹痰上蒙清窍,发为中风[10,13-14],故基于此病机创制了温阳复元方治疗本病。该方中附片刚中带柔,可温坎水,大补少阴之肾阳为君药。臣以黄芪补气升阳,大补脾胃之气,气行则血行,有行滞通络之效;党参助黄芪补脾肺之气;辛热之干姜温中散寒,助附子温脾胃之阳。淫羊藿祛风除湿、补肾壮阳,引阳入阴,通达内外;石菖蒲化痰开窍,安神定志;田三七活血化瘀止血;上三药为佐药,炙甘草为使药。诸药合用,共奏温阳益气、化痰通络之功。为探讨该方对脑缺血再灌注大鼠线粒体铁死亡的影响,本研究以治疗缺血性中风的经典方补阳还五汤为对照进行了相关研究。

线粒体铁死亡是一种铁依赖的调节性坏死,通过影响铁代谢或脂质过氧化在缺血性中风的发展中起着重要作用,有研究发现抑制线粒体铁死亡可以成功逆转缺血性损伤[3,15]。细胞的铁离子平衡受到严格的调控,在细胞缺铁时最大限度地增加铁的供应,而当细胞缺铁时限制铁离子的供应,并促进其储存。这种调节可以发生在不同的层面,但最常见的是IRP1和IRP2与编码各种铁离子相关蛋白[16]的信使RNA非翻译区(UTRs)中的干细胞环结构[铁反应元件(IRE)]的铁依赖性结合[17]。当细胞铁浓度低时,IRP1处于与mRNA结合的构象。IRP1与铁蛋白mRNA的5′UTR的结合阻止了翻译,从而确保在不需要储存铁的时候产生少量的铁蛋白;同时,IRP1与TfR1 mRNA的3′UTR中的铁调节蛋白(IRPs)结合,从而保护信息不被降解,使更多的TfR1在细胞膜上表达。这种作用反过来使细胞能够最大限度地摄入铁离子。当细胞铁离子浓度高时,IRP1不与IREs结合,从而允许铁蛋白mRNA的翻译继续进行,并使TfR1 mRNA暴露与降解。这些条件限制了细胞对铁离子的吸收并促进了其储存。FAM96A仅存在于少数生物体中,并作为IRP1的专用Fe/S簇成熟因子,从而对哺乳动物的细胞铁离子平衡调节产生直接影响[6]。有研究表明,提高大鼠海马内IRP1的表达量,进而使TfR表达量增加,铁蛋白表达量减少,最终导致大鼠脑内铁稳态失衡,相应脑区铁离子含量增加[18]。Casarrubea等[19]研究发现IRP1过表达会导致细胞铁代谢紊乱,强调了适当的IRP1调节在铁代谢的中枢器官中的重要性。

本实验结果发现,大鼠脑缺血再灌注后脑组织中IRP1和FAM96A的表达显著增加,其直接结果导致铁离子内流增加,而外输减少,致使神经元线粒体结构破坏而铁死亡发生;温阳复元汤可下调IRP1和FAM96A的表达,促进细胞内铁的外排,减少神经元损伤,发挥神经保护作用,且其作用明显优于补阳还五汤。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。