miR-499通过Drp1介导线粒体自噬保护缺氧/复氧心肌细胞

吴静 聂祖琼 尹琬凌

华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院老年病科（武汉 430000）

近年来，我国人民的饮食结构随着经济水平的提高而发生变化，导致心血管疾病的发生率也逐年升高，已成为中老年人生命安全的重大威胁。而缺血性心脏病在心血管疾病中是病死率较高的疾病之一［1］。心肌缺血主要是由于冠状动脉阻塞或狭窄引起供血不足导致心脏血流量减少、供氧不足，从而出现心肌损伤，严重时危及患者生命。治疗缺血性心脏病的主要措施是恢复心脏的供血，临床上主要采用药物治疗、冠状动脉介入治疗和旁路移植等方法［2-3］。但是再灌注会导致一系列不良后果，这一过程称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）［4］。心肌细胞内含大量线粒体以供其能量需求［5］。在心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）时会导致线粒体受损以致最终细胞死亡［6］。线粒体分裂蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）是线粒体重要的分裂蛋白，其缺失可能导致线粒体功能障碍，并增加MIRI 的易感性［7］。在正常生理状态下，心肌细胞内富含miR-499，当心肌缺血时miR-499含量显著降低［8］。因此，本研究通过建立心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，使用miR-499 mimics 及Drp1 抑制剂P110 处理，探究miR-499 在MIRI 中的作用，并从线粒体自噬方面探究其可能机制，为其在治疗MIRI 方面提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 H9c2（2-1）细胞来源中国科学院上海细胞库。DMEM（Hyclone公司）；胎牛血清、Opti-MEM（Gibco 公司）；PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK8、10 mmol/L dNTP Mix、RIPA（强）组织细胞快速裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（solarbio）；Lipofectamine®RNAiMAX（Invitrogen 公司）；P110（Selleck）；活性氧（ROS）检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（beyotime）；AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（BD）；总超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、ATP 含量测试盒（南京建成）；Trizol（ambion）；SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems）；Oligo （dT）18 Primer、PrimeScript ⅡRTase、Recombinant Rnase Inhibitor（TAKARA）；兔抗Fis1、Mfn1、DNM1L（Drp1）、Parkin、LC3-Ⅱ、p62、GAPDH 抗体、羊抗兔IgG 抗体（bioswamp）。DMIL LED 倒置荧光显微镜、S6E 切片机（Leica 公司）；AMR-100 酶标仪、Icen-24R 高速冷冻离心机、超微量分光光度计（杭州奥盛）；NovoCyte 流式细胞仪（艾森）；GE48527PCR 仪（杭州柏恒）；CFX-Connect 96荧光定量PCR仪（Bio-Rad）；Tanon-5200全自动化学发光分析仪（上海天能）；HT7700透射电镜（日立）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将冻存的细胞复苏后于37 ℃，5% CO2的培养箱内培养。将细胞分为（1）对照组（BC）：不做处理；（2）I/R 组（I/R）：放置于3.3 mmol/L H2O2培养10 min，然后在DMEM 培养基中恢复30 min；（3）I/R + miR-499 mimics 组（I/R + mi）：miR-499 mimics转染H9C2细胞，细胞经过10 min缺氧和30 min 复氧处理；（4）I/R + miR-499 NC 组（I/R +NC）：miR-499 NC 转染H9C2 细胞，细胞经过10 min缺氧和30 min 复氧处理；（5）I/R + miR-499 mimics+ P110 组（I/R + mi + P110）：miR-499 mimics 转染后1 µmol/L P110［9］处理H9C2 心肌细胞3 h 并进行10 min 缺氧和30 min 复氧处理；（6）I/R + miR-499 NC + P110 组（I/R + NC + P110）：miR-499 NC 转染后1 µmol/L P110 处理H9C2 心肌细胞3 h 并进行10 min 缺氧和30 min 复氧处理。

1.2.2 细胞转染 转染前24 h 接种于6 孔板，转染时细胞融合度为70%。转染步骤如下：（1）在250 µL Opti-MEM中加入100 pmol miRNA，吹吸混匀；（2）在250 µL Opti-MEM中加入5 µL Lipofectamine®RNAiMAX，吹吸混匀，室温下静置5 min；（3）将（1）、（2）步骤液体混合、吹吸混匀，室温孵育20 min；（4）将（3）中液体加入换有新鲜培养基的培养板细胞中，轻轻摇晃培养板；（5）将培养板置于37 ℃，5% CO2的培养箱内，转染4 h 后换新鲜培养基继续培养48 h；（6）检测转入基因表达水平。

1.2.3 CCK8 检测细胞增殖抑制率 将细胞于96孔中培养过夜，按1.2.1中分组处理细胞，继续培养30 min 后，每孔加入10 µL CCK8 溶液培养4 h后在酶联免疫检测仪450 nm 处测量各孔吸光值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞ROS、线粒体膜电位和细胞凋亡 按照ROS、线粒体膜电位和AnnexinVFITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书处理后，在流式细胞仪上检测。ROS 和线粒体膜电位使用NovoCyte分析软件进行分析，细胞凋亡使用NovoExpress 分析软件进行分析。

1.2.5 生化检测 按照SOD、MDA 和ATP 测试盒说明书进行处理后，分别于450、532和636 nm处检测吸光度。

1.2.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达水平 Trizol 法提取细胞RNA，反转录获得第一链cDNA。采用qRT-PCR 检测miR-499、Fis1、Mfn1、Drp1、Parkin、LC3-Ⅱ、p62 基因表达水平，miR-499 以U6 作为内参，其余以GAPDH 作内参基因，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7 Western blot 法检测蛋白表达水平 使用RIPA（强）组织细胞快速裂解液获得细胞蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。经SDSPAGE 胶的制备、上样及电泳、转膜、膜的封闭及抗体孵育后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，通过TANON GIS 软件读取相关条带灰度值。

1.2.8 透射电镜观察线粒体自噬 将样本经固定、浸透和包埋、超薄切片、染色后于透射电镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法 本实验中的生物学重复均为3（n= 3），数据以均值±标准差表示，使用SPSS 23.0软件对数据进行单因素方差分析和DUNCAN 多重比较，P＜ 0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-499 转染效率 相比对照组/miR-499 mimics NC 组，miR-499 mimics 组中miR-499 的mRNA 表达水平显著增加，见图1。表示miR-499 mimics 细胞H/R 模型构建成功。

图1 miR-499 mimics 转染效率Fig.1 Transfection efficiency of miR-499 mimics

2.2 miR-499 mimics 对缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞细胞增殖的影响 相对I/R 和I/R + NC组，I/R + mi 和I/R + NC + P110 组的细胞增殖抑制率均显著下降（P＜ 0.05）；相对I/R + mi 和I/R +NC + P110 组，I/R + mi + P110 组的细胞增殖抑制率显著下降（P＜ 0.05）。见图2。

图2 miR-499 mimics 处理后的细胞增殖抑制率Fig.2 The cell inhibiting rate after miR-499 mimics treatment

2.3 miR-499 mimics 对H/R 诱导的心肌细胞凋亡率的影响 相比BC 组，I/R 与I/R + NC 组的细胞凋亡率显著上升（P＜ 0.05）；相比I/R 与I/R + NC 组，I/R + mi 和I/R + NC + P110 组的细胞凋亡率显著下降（P＜ 0.05）；相比I/R + mi 和I/R + NC + P110 组，I/R + mi + P110组的细胞凋亡率显著下降（P＜ 0.05）。见图3。

图3 miR-499 mimics 处理后的细胞凋亡率Fig.3 The apoptosis rate after miR-499 mimics treatment

2.4 miR-499 mimics 对H/R 诱导的心肌细胞氧化应激的影响 相比BC 组，I/R 与I/R + NC 组细胞中的ROS 和MDA 含量显著上升（P＜ 0.05），SOD 含量显著下降（P＜ 0.05）；相比I/R 与I/R + NC 组，I/R +mi和I/R + NC + P110组细胞中的ROS和MDA含量显著下降（P＜ 0.05），SOD含量显著上升（P＜ 0.05）；相比I/R + mi和I/R + NC + P110组，I/R + mi + P110组ROS 和MDA 含量显著下降（P＜ 0.05），SOD 含量显著上升（P＜ 0.05）。见图4。

图4 miR-499 mimics 处理后细胞氧化应激相关因子指标的变化情况Fig.4 Changes in cell oxidative stress-related factors after miR-499 mimics treatment

2.5 miR-499 mimics 对H/R 诱导的心肌细胞线粒体膜电位的影响 相比BC 组，I/R 与I/R + NC 组细胞的线粒体膜电位显著上升（P＜ 0.05）；相比I/R与I/R + NC组，I/R + mi和I/R + NC + P110组细胞的线粒体膜电位显著下降（P＜ 0.05）；相比I/R + mi和I/R + NC + P110 组，I/R + mi + P110 组细胞的线粒体膜电位显著下降（P＜ 0.05）。见图5。

图5 miR-499 mimics 处理后细胞的线粒体膜电位Fig.5 Mitochondrial membrane potential in cells treated with miR-499 mimics

2.6 miR-499 mimics 对H/R 诱导的心肌细胞线粒体自噬的影响 相比BC 组，I/R 与I/R + NC 组细胞的线粒体自噬增加；相比I/R与I/R + NC组，I/R + mi和I/R + NC + P110组细胞的线粒体自噬减少；相比I/R + mi和I/R + NC + P110组，I/R + mi + P110 组细胞的线粒体自噬减少。见图6。

图6 miR-499 mimics 处理后细胞的线粒体自噬Fig.6 Mitochondrial autophagy in cells treated with miR-499 mimics

2.7 miR-499 mimics 对H/R 诱导的心肌细胞中ATP 含量的影响 相比BC 组，I/R 与I/R + NC组细胞中线粒体含量显著下降（P＜ 0.05）；相比I/R 与I/R + NC组，I/R + mi和I/R + NC + P110组细胞中线粒体含量显著上升（P＜ 0.05）；相比I/R + mi和I/R +NC + P110 组，I/R + mi + P110 组细胞中线粒体含量显著上升（P＜ 0.05）。见图7。

图7 miR-499 mimics 处理后细胞中ATP 含量变化Fig.7 Changes in ATP content in cells treated with miR-499 mimics

2.8 miR-499 mimics 对H/R 诱导的心肌细胞中线粒体分裂、融合、自噬相关基因和蛋白表达水平的影响 相比BC 组，I/R 与I/R + NC 组细胞中Fis、Parkin、LC3-Ⅱ和Drp1 的基因和蛋白表达水平显著上升（P＜0.05），Mfn1 和p63 的基因和蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）；相比I/R 与I/R + NC 组，I/R + mi 和I/R + NC + P110 组细胞中Fis、Parkin、LC3-Ⅱ和Drp1 的基因和蛋白表达水平显著下降（P＜ 0.05），Mfn1 和p63 的基因和蛋白表达水平显著上升（P＜ 0.05）；相比I/R + mi 和I/R + NC + P110组，细胞中Fis、Parkin、LC3-Ⅱ和Drp1 的基因和蛋白表达水平显著下降（P＜ 0.05），Mfn1 和p63 的基因和蛋白表达水平显著上升（P＜ 0.05）。见图8。

图8 miR-499 mimics 处理后细胞中线粒体分裂、融合、自噬相关基因mRNA 和蛋白表达水平Fig 8 The mRNA and protein expression levels of mitochondrial division，fusion，and autophagy-related genes in cells treated with miR-499 mimics

3 讨论

miRNA 是一类小分子RNA，广泛存在于真核生物细胞中，在心脏疾病的发生发展中发挥重要作用［10］。研究发现［8］，miR-499 在心肌细胞中特异性表达，与心肌细胞的分化密切相关，且可以抑制心肌细胞的凋亡［11］。本研究中miR-499 mimics 和（或）Drp1 抑制剂P110 处理I/R 诱导的心肌细胞后，细胞的增殖抑制率和凋亡率都显著下降，表示miR-499 对心肌细胞具有保护作用。

机体内许多生理过程都参与MIRI，包括内质网应激、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、自噬、ATP 能量代谢障碍、钙超载、氧自由基爆发等［12］。其中，自噬发挥着重要作用，其依赖溶酶体将细胞内受损的细胞器降解以维持细胞稳态［13］。在I/R发生时，突发的供血供氧会导致线粒体中发生大量活性氧的生成、氧化应激及炎症反应等，导致线粒体的受损，从而引起心肌细胞能量供应障碍、促凋亡因子的释放，最终导致细胞死亡［6］。因此，及时清除受损线粒体，维持细胞的正常功能，对治疗MIRI 十分重要。线粒体自噬是一种特殊的自噬，能够将细胞内损伤的线粒体降解清除，对维持心肌细胞稳定具有重要意义［14］。当心肌缺血时，线粒体自噬被激活，清除细胞内受损的线粒体，减少氧化应激的发生以保护心肌细胞；当再灌注时，线粒体自噬被过度激活，正常的线粒体被清除，导致心肌功能损伤加重［15］。因此，在MIRI 中调控线粒体自噬成为了治疗缺血性心脏病中的重要策略之一。在线粒体动力学中，由一组GTP 酶来调节线粒体的融合和分裂，线粒体融合蛋白Mfn1 在线粒体外膜的融合过程中发挥重要作用［16］。线粒体的分裂是将膜电位受损的子线粒体从健康的线粒体中分裂出来。正常膜电位的子线粒体可以与其他线粒体融合，膜电位降低的子线粒体不能与其他线粒体融合，而是被溶酶体吞噬降解［17］，从而形成线粒体自噬。Drp1是GTP 酶超家族蛋白成员之一，主要存在于细胞质中。Drp1 从细胞质向线粒体募集的过程是线粒体分裂的重要步骤［18］，这个过程由几个线粒体膜蛋白介导，其中包括Fis1［19］。线粒体自噬可依赖泛素途径与LC3 结合介导，由假定激酶PINK1 和Parkin 调控［20］。p62 是LC3 的适配器蛋白［21］。本研究中，miR-499 mimics 和（或）P110 处理I/R 诱导的心肌细胞后，细胞中ATP 含量上升，线粒体膜电位下降，自噬发生减少，且Fis1、Parkin、LC3-Ⅱ、Drp1 基因的mRNA 和蛋白表达水平均下降，而Mfn1 和p62 基因的mRNA 和蛋白表达水平均上升，表明miR-499 可以使细胞中线粒体膜电位去极化，线粒体融合上升，线粒体自噬下降，且与Drp1有密切关系。

细胞自噬与氧化应激存在相互作用［22］。MIRI时心肌细胞中的线粒体发生功能障碍，产生过量自由基，激活氧化应激，产生大量MDA、ROS。机体存在许多防御过程对抗氧化应激，包括GSHPx、CAT 及SOD 等［23］。本研究中，miR-499 mimics和（或）P110 处理I/R 诱导的心肌细胞后，细胞中ROS、MDA 含量下降，SOD 含量上升，表明miR-499可以降低I/R 诱导导致的心肌细胞中氧化应激的升高。

综上所述，miR-499 可使I/R 诱导的心肌细胞增殖抑制率降低、凋亡率降低，且通过Drp1 介导降低细胞线粒体自噬、减少氧化应激从而保护细胞。本研究完善了miR-499 减轻MIRI 的机制研究，为靶向治疗MIRI 提供了新思路。

【Author contributions】WU Jing designed the study，performed the experiments and wrote the article.NIE Zuqiong performed the experiments YIN Wanling revised the article and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.