CircLRP6调节miR-125a-5p/MCL1轴对食管鳞癌顺铂耐药性的影响

林萍萍 李富博 王东娟 郭研 董怡

承德医学院附属医院肿瘤科（河北承德 067000）

食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌的主要亚型，顺铂（cisplatin，CDDP）是治疗ESCC 的首选药物［1-2］。然而，耐药性限制了CDDP 的实际效果与临床应用［3］。环状RNA（circRNA）为一种参与CDDP 耐药的非编码基因［4］。环状RNA 脂蛋白受体6（circular RNA lipoprotein receptor 6，circLRP6）是ESCC 中的一种新型致癌circRNA，其表达水平在ESCC中增加，可促进ESCC肿瘤发生［5］。然而，circLRP6 对ESCC 化疗耐药的影响和机制尚未完全阐明。

通过生物信息学数据库对circLRP6的靶miRNA进行预测，发现circLRP6 序列与多种miRNA 存在互补的结合位点，通过对比既往的文献报道，筛选其中与“CDDP 耐药”、“食管癌”、“ESCC”相关的靶miRNA，最终miRNA-125a-5p（miR-125a-5p）被选定为circLRP 的靶基因。因为miR-125a-5p 已被证实参与多种肿瘤的CDDP 耐药，包括宫颈癌［6］、口腔鳞状细胞癌［7］和ESCC［8］。据报道，miR-125a-5p 在ESCC中呈低表达，过表达miR-125a-5p可增强ESCC细胞对CDDP 的敏感性［8］。此外，生物信息学预测显示，miR-125a-5p 与髓样细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）的3'-UTR 区存在结合位点。MCL-1 高表达是癌细胞逃避化疗试剂诱导的细胞死亡的关键因素［9-10］。在ESCC 中靶向下调MCL-1 可恢复其对CDDP 化疗的敏感性［11］。本研究旨在阐明这三个分子在ESCC 的CDDP 耐药中的调控网络，以期为ESCC 的耐药机制研究和靶向治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床样本 收集2019 年1 月至2022 年1 月在本院接受切除手术的ESCC 患者，共获得60 对ESCC 组织样本（ESCC 组，其中Ⅰ、Ⅱ期36 例，Ⅲ期24 例；CDDP 耐药27 例，CDDP 敏感患者33 例）及癌旁组织样本（对照组），组织立即在液氮中冷冻，然后储存在-80 ℃冰箱中用于mRNA 提取和分析。年龄范围为50 ～ 72 岁，平均为（60.1 ± 7.5）岁，所有患者均接受CDDP 治疗。CDDP 耐药患者为基于CDDP 的化疗期间肿瘤复发，CDDP 敏感患者为基于CDDP 的化疗期间没有肿瘤复发。纳入标准：（1）经病理检查确诊为ESCC 者；（2）患者均为在本院初诊初治的行CDDP 规范化疗的病例；（3）有完整的临床资料，可进行随访（包括肿瘤复发时间和总生存期）。排除标准：（1）合并心脑卒中、免疫缺陷病或自身免疫疾病、血液系统疾病者；（2）术前接受过除CDDP 外的其他抗肿瘤治疗；（3）合并食管外恶性肿瘤者。本研究经医院伦理委员会批准（审批号：201901003），并获得所有患者的知情同意。

1.2 细胞培养 人正常食管上皮细胞株Het-1A 购自上海烜雅生物科技有限公司（XY-XB-1467），人ESCC 细胞株（KYSE-150、KYSE-30、TE-1 和EC109）购自武汉普诺赛生命科技有限公司（CL-0638、CL-0577、CL-0231、CL-0077）。细胞均用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素的RPMI-1640 培养基，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.3 CDDP 抗性细胞系的建立 KYSE30 的CDDP抗性细胞（KYSE30/CDDP-R）是通过在6 个月内逐渐增加浓度的CDDP（从0.2 ～ 10 µmol/L）建立的。在RPMI-1640 培养基中加10% FBS，将处于对数期的KYSE30 细胞以0.2 µmol/L 的初始浓度暴露于CDDP。48 h 后，用PBS 洗涤处理过的KYSE30 细胞3 次，并在不含CDDP 的RPMI-1640 培养基中培养。在达到70% ～ 80%汇合时，ESCC 细胞以较高浓度暴露于CDDP（每代增加10% ～ 20%）。重复上述处理直至达到10 µmol/L 的浓度，得到对CDDP具有抗性的KYSE30 细胞。

1.4 主要试剂与仪器 靶向circLRP6 的小分子干扰RNA（circLRP6 siRNA，si-circLRP6）、miR-125a-5p mimic 和miR-125a-5p inhibitor 及其阴性对照（si-NC、miR-NC 和inhibitor-NC）购自广州RiboBio公司；SYBR Green Premix Ex Taq 荧光定量试剂盒（RR820A）、PrimeScript 逆转录试剂盒（RR037A）购自日本TAKARA 公司；miRNA 逆转录试剂盒（LM-130957）和miRNA 荧光定量PCR 试剂盒（LM-0132）购自上海联迈生物工程公司等。

1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测组织/细胞中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 mRNA表达 从组织/细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA 后进行PCR 扩增，检测circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 表达，GAPDH、U6 为内参。为了验证circLRP6 在KYSE30/CDDP-R 细胞中的稳定性，总RNA（2 µg）在37 ℃下孵育30 min，用或不用3 U/µg RNase R处理KYSE30/CDDP-R细胞以验证circRNA的环状特征。基因的相对表达量由2-ΔΔCt法计算。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR 引物Tab.1 RT-qPCR primers

1.6 KYSE30 细胞和KYSE30/CDDP-R 细胞对CDDP 的敏感性检测 将KYSE30 细胞和KYSE30/CDDP-R 细胞消化后重悬并接种到96 孔板（2 ×103个细胞/孔）。用不同剂量（0、1、2、5、10 和15 µmol/L）的CDDP 处理48 h。每孔加入10 µL CCK-8 溶液并再孵育2 h。在酶标仪上检测各孔在450 nm 处的吸光度（A）值，计算细胞活力。通过相对存活曲线分析CDDP 的半数抑制浓度（IC50）。细胞活力（%） = （CDDP 处理组A值/对照组A值）× 100%。

1.7 Western blot 检测细胞中MCL-1 蛋白表达 从细胞中提取总蛋白，将等量蛋白质（50 µg/泳道）通过10% SDS-PAGE 分离并转膜，封闭膜2 h，与一抗MCL-1（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）在4 ℃下孵育过夜。室温下将二抗（1∶5 000）添加到膜中孵育2 h。显影，Image J 1.8.0 版软件用于灰度分析；GAPDH 为内参。

1.8 流式细胞仪分析细胞凋亡 转染后用10 µmol/L CDDP 处理各组细胞48 h，然后收集、洗涤和重悬各组细胞，加入5 µL Annexin V-FITC 和5 µL PI，避光孵育15 min 以染色细胞。用流式细胞仪分析凋亡细胞。

1.9 统计学分析 数据表示为均值±标准差，使用GraphPad Prism 8.0 进行分析。两组间比较采用t检验，单向方差分析和SNK-q检验用于多组间比较（两组以上）。circLRP6 和miR-125a-5p、miR-125a-5p 和MCL-1 以及miR-125a-5p 和circLRP6 之间的相关性是通过Pearson 相关性分析来确定的。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CircLRP6 的结构稳定性验证 CircLRP6 来源于LRP6 基因的外显子2，其剪接成熟序列长度为394 bp（图1A）；然后发现circLRP6 相对于线性LRP6 mRNA 可显著抵抗RNase R 降解（图1B），表明circLRP6 比LRP6 更稳定。

图1 circLRP6 的结构稳定性验证Fig.1 Structural stability verification of circLRP6

2.2 CircLRP6 在ESCC 组织和细胞中的表达 与对照组相比，ESCC 组癌组织中circLRP6、MCL-1 mRNA水平升高，miR-125a-5p水平降低（P＜ 0.001）（图2）。根据RT-qPCR 确定的circLRP6 表达水平的平均值将ESCC 患者分为两组，高于或低于平均值的circLRP6 表达分别被认为是高或低表达，发现circLRP6 表达与CDDP 敏感性、TNM 分期和淋巴结转移相关（P＜ 0.05，表2）。此外，CDDP 耐药患者癌组织中circLRP6、MCL-1 mRNA 水平高于CDDP 敏感患者，而miR-125a-5p 水平低于CDDP 敏感患者（P＜ 0.001，图3）。

图2 ESCC 患者癌组织中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 mRNA 表达比较Fig.2 Comparison of circLRP6，miR-125a-5p and MCL-1 mRNA expression in cancer tissues of ESCC patients

图3 CDDP 耐药/敏感患者癌组织中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 mRNA 表达比较Fig.3 Comparison of circLRP6，miR-125a-5p and MCL-1 mRNA expression in cancer tissues of CDDP-resistant/sensitive patients

表2 CircLRP6 表达与ESCC 患者临床特征的相关性Tab.2 Correlation between CircLRP6 expression and clinical characteristics of ESCC patients

与Het-1A 细胞相比，ESCC 细胞株中circLRP6和MCL-1 mRNA 水平升高，miR-125a-5p 水平降低（P＜ 0.001），KYSE-30 细胞中circLRP6 和MCL-1 mRNA 水平最高，miR-125a-5p 水平最低（P＜ 0.05，图4）。故选择KYSE-30 细胞为后续实验对象。

图4 不同人ESCC 细胞中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 mRNA 表达水平比较（n = 6）Fig.4 Comparison of circLRP6，miR-125a-5p and MCL-1 mRNA expression levels in different human ESCC cells （n = 6）

2.3 KYSE30 细胞和KYSE30/CDDP-R 细胞对CDDP 的敏感性 与KYSE30 细胞相比，KYSE30/CDDP-R 细胞中CDDP 的IC50增加（表3）。此外，KYSE30/CDDP-R 细胞中circLRP6 表达水平［（3.06± 0.27）vs.（1.02 ± 0.14），P＜ 0.05］和MCL-1 mRNA水平［（3.59 ± 0.30）vs.（1.01 ± 0.12），P＜ 0.05］高于KYSE30 细胞，miR-125a-5p 水平低于KYSE30 细胞［（0.25 ± 0.04）vs.（1.00 ± 0.09），P＜ 0.05］。

表3 DDP 对HCT116 细胞和HCT116/DDP 细胞活力的影响Tab.3 Effects of DDP on the viability of HCT116 cells and HCT116/DDP cells ±s

表3 DDP 对HCT116 细胞和HCT116/DDP 细胞活力的影响Tab.3 Effects of DDP on the viability of HCT116 cells and HCT116/DDP cells ±s

注：与对照组（0）相比，*P ＜ 0.05

CDDP浓度（µmol/L）细胞活力（%）KYSE30细胞100.00 ± 0.00 81.35 ± 4.57*65.40 ± 4.10*42.63 ± 3.95*30.91 ± 3.42*21.74 ± 2.83*3.981 0 1 2 5 10 15 IC50（µmol/L）KYSE30/CDDP-R细胞100.00 ± 0.00 97.72 ± 9.81 91.58 ± 9.35 78.30 ± 8.22*65.45 ± 7.16*51.20 ± 5.94*20.300

2.4 沉默circLRP6 对KYSE30/CDDP-R 细胞中miR-125a-5p 和MCL-1 表达的影响 与Control组、si-NC 组比较，si-circLRP6 组circLRP6、MCL-1的mRNA 和蛋白水平降低，miR-125a-5p 水平升高（P＜ 0.05）；与si-circLRP6 组、si-circLRP6+anti-NC组比较，si-circLRP6+anti-miR-125a-5p 组MCL-1 的mRNA 和蛋白水平升高，miR-125a-5p 水平降低（P＜ 0.05）。见图5。

图5 各组KYSE30/CDDP-R 细胞中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 表达水平比较（n = 6）Fig.5 Comparison of expression levels of circLRP6，miR-125a-5p and MCL-1 in KYSE30/CDDP-R cells in each group （n = 6）

2.5 沉默circLRP6 对KYSE30/CDDP-R 细胞CDDP 敏感性的影响 与Control 组、si-NC 组比较，si-circLRP6 组KYSE30/CDDP-R 细胞中CDDP的IC50降低；与si-circLRP6 组、si-circLRP6+anti-NC组比较，si-circLRP6+anti-miR-125a-5p 组KYSE30/CDDP-R 细胞中CDDP 的IC50升高（P＜ 0.05）；见表4。

表4 沉默circLRP6 对KYSE30/CDDP-R 细胞CDDP 敏感性的影响Tab.4 Effects of silencing circLRP6 on CDDP sensitivity of KYSE30/CDDP-R cells ±s

表4 沉默circLRP6 对KYSE30/CDDP-R 细胞CDDP 敏感性的影响Tab.4 Effects of silencing circLRP6 on CDDP sensitivity of KYSE30/CDDP-R cells ±s

注：与对照组（0）相比，*P ＜ 0.05

CDDP浓度（µmol/L）细胞活力（%）si-circLRP6+anti-miR-125a-5p 100.00 ± 0.00 92.35 ± 9.18 81.64 ± 8.20*69.50 ± 6.93*54.71 ± 5.82*43.62 ± 5.01*12.150 si-NC 100.00 ± 0.00 96.20 ± 9.57 92.16 ± 9.14 80.25 ± 8.56*67.10 ± 7.08*51.33 ± 5.65*21.325 0 1 2 5 10 15 IC50（µmol/L）Control 100.00 ± 0.00 95.80 ± 9.64 88.75 ± 9.20 77.43 ± 8.15*64.92 ± 6.83*50.75 ± 5.42*20.114 si-circLRP6 100.00 ± 0.00 75.71 ± 8.05*61.43 ± 7.02*49.25 ± 6.01*41.96 ± 4.86*32.52 ± 3.74*4.982 si-circLRP6+anti-NC 100.00 ± 0.00 79.99 ± 8.02*64.36 ± 6.15*48.28 ± 5.64*37.53 ± 5.01*30.41 ± 3.69*4.854

2.6 沉默circLRP6 对CDDP 诱导的KYSE30/CDDP-R 细胞凋亡的影响 与Control 组、si-NC 组比较，si-circLRP6 组KYSE30/CDDP-R 细胞凋亡率升高（P＜ 0.05）；与si-circLRP6 组、si-circLRP6+anti-NC 组比较，si-circLRP6+anti-miR-125a-5p 组KYSE30/CDDP-R 细胞凋亡率降低（P＜ 0.05）；见图6。

图6 各组KYSE30/CDDP-R 细胞凋亡情况（流式细胞术）Fig.6 Apoptosis of KYSE30/CDDP-R cells in each group （flow cytometry）

3 讨论

circRNA 在肿瘤耐药性过程中发挥重要作用［13］。据报道，circLRP6 可促进骨肉瘤细胞生长和转移［14］；并可驱动ESCC 的肿瘤发生［5］。本研究发现，circLRP6 在ESCC 患者中的高表达与CDDP敏感性、TNM 分期和淋巴结转移相关，且circLRP6在CDDP 耐药ESCC 患者中的表达高于CDDP 敏感患者，表明circLRP6 可能与CDDP 耐药相关。基于上述临床意义，笔者建立了抗CDDP 的ESCC 细胞系，以进一步研究circLRP6 可能的功能机制。结果显示，敲低circLRP6 后，CDDP 抗性ESCC 细胞对CDDP 的敏感性增强，且增加了CDDP 诱导细胞凋亡。CircRNA 的功能部分取决于其亚细胞定位［15］。为了确定circLRP6 的功能机制，笔者首先检测了它在ESCC 细胞中的亚细胞定位，发现它主要位于细胞质中，这与之前的研究［5］一致。对于细胞质circRNA，充当海绵miRNA 是circRNA 调节化疗相关靶基因常见和重要的转录后机制［16］。在宫颈癌中，miR-125a-5p 可通过下调LIM 激酶1 使宫颈癌细胞对CDDP 敏感，从而增加CDDP 的抗癌功效［6］。在本研究中，ESCC 标本中miR-125a-5p 与circLRP6呈负相关，且与CDDP敏感患者相比，在CDDP耐药患者中miR-125a-5p 表达水平降低；表明circLRP6与miR-125a-5p 之间可能存在结合。此外，RIP 分析显示circLRP6 与miR-125a-5p 在ESCC 细胞中占据相同的Ago2 位点形成RNA 诱导的沉默复合物（RISC），表明它们的相互作用可能影响下游mRNA的表达。此外，抑制miR-125a-5p 减弱了circLRP6沉默对CDDP 抗性ESCC 细胞中CDDP 耐药性和细胞凋亡的影响。提示，沉默circLRP6 可能通过靶向上调miR-125a-5p 提高ESCC 中CDDP 的敏感性。MCL-1是一种关键的抗凋亡蛋白，据报道，MCL-1通过充当miR-148a-3p的靶标来抑制ESCC的进展［17］。YU等［11］揭示了MCL-1在ESCC中增加，敲低其表达可增强ESCC 细胞对CDDP 诱导的细胞凋亡。在本研究中，MCL-1 在CDDP 抗性ESCC 组织和细胞中升高，且CDDP 耐药患者中MCL-1 的表达水平高于CDDP 敏感患者。

综上所述，本研究首次探讨了circLRP6 在CDDP 抗性中的作用。这些结果揭示了circLRP6敲低通过miR-125a-5p/MCL-1 轴增强了CDDP 抗性ESCC 细胞对CDDP 的敏感性。本研究为ESCC 靶向治疗提供了新的思路，对于全面了解肿瘤细胞耐药机制具有重要意义。然而，本研究存在一定的局限性。例如，circLRP6 可能靶向多个miRNA，且miR-125a-5p 可能与多个基因的3'-UTR 结合；circLRP6对CDDP耐药性的影响是否有其他miRNA/mRNA 参与，仍需进一步证实。

【Author contributions】LIN Pingping performed the experiments and wrote the article.LI Fubo performed the experiments.WANG Dongjuan and GUO Yan revised the article.DONG Yi designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.