BVDV-1 E2蛋白抗原表位的串联表达及其多克隆抗体的制备

陈小金，张俊哲，曲 鹏，侯文婷，殷其刚，赵 丹，霍 蕾，肖 妍，张海滨

（1.天津海关工业产品安全技术中心，天津 300461；2.天津海关动植物与食品检测中心，天津 300461；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea，BVD）又称牛病毒性腹泻-黏膜病，临床上以发热、腹泻、黏膜病变以及怀孕母牛繁殖障碍为主要特征[1]，其病原为牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）。除造成以上临床症状外，该病还能导致患畜免疫力降低，继而引起其他病原的继发感染，使病畜死亡率明显增加，给全世界养牛业造成了重大经济损失[2-3]。

根据5'UTR和自体蛋白酶的差异，BVDV可分为两种基因型——I型（BVDV-1）和II型（BVDV-2），目前我国流行的主要是BVDV-1[4]。在BVDV粒子表面的3种囊膜蛋白（Erns、E1和E2）中，E2蛋白是含量最丰富的表面蛋白，且包含BVDV主要的中和抗原位点，其诱导机体产生的中和抗体能预防BVDV感染[5]。E2蛋白通过二硫键形成的E2-E2同源二聚体和E2-E1异二聚体，镶嵌在病毒粒子表面[6]。E2蛋白在BVDV入侵过程中，帮助病毒附着在宿主细胞上，促进病毒进入细胞完成复制和增殖，且决定了病毒的种属嗜性[7]。鉴于E2蛋白功能多样性及重要性，E2蛋白一直是研究BVDV的主要热点蛋白，有关其表达及免疫原性的研究屡见报道[8]。

BVDV是黄病毒科瘟病毒属成员，同属成员包括猪瘟病毒（CSFV）、羊边界病病毒（BDV）等[9]。E2蛋白是瘟病毒最主要的抗原蛋白，在不同种间含有部分共同抗原表位及特异性抗原表位，由此带来了血清学交叉反应。BVDV与CSFV均能感染猪，因此猪群中这2种病原的抗体检测可相互干扰，给疾病诊断和防控带来挑战[10]。

本研究选取BVDV E2蛋白的5个保守抗原表位，以柔性氨基酸（GSGS）将5个表位（E1～5）串联（串联的多肽链被命名为5BE），利用原核表达系统表达重组蛋白His-5BE，纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体并鉴定抗体的反应性，以期为制备单克隆抗体及建立BVDV检测方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

质粒pET-28a（+），由宜春学院病原微生物实验室保存；感受态细胞TOP10和BL21（DE3），购自上海唯地生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

2×RapidTaqMaster Mix和DL 2 000 plus DNA Maker，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；HRP标记的羊抗鼠IgG、通用型ECL发光底物、BCA蛋白定量试剂盒、预染蛋白Maker，均购自上海圣尔生物科技有限公司；限制性核酸内切酶BamHI和XhoI，购自NEB（北京）有限公司；T4 DNA连接酶，购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；PCR凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白），购自康为世纪生物有限公司。

1.3 基因合成及引物合成

按照图1所示基因序列，合成编码5BE多肽链基因。5BE编码基因由通用生物（安徽）股份有限公司合成，以pUC-5BE质粒形式提供。为将5BE编码基因克隆到原核表达载体pET-28a（+），设计一对携带酶切位点的引物5BE-F和5BE-R，通过BamHI和XhoI酶切位点连入pET-28a（+）载体。同时，设计一对载体引物pET-28a-F和pET-28a-R，用于鉴定在pET-28a（+）载体多克隆位点区插入的目的基因（表1）。

表1 设计的引物序列

图1 BVDV E2蛋白抗原表位的串联

1.4 重组载体构建与鉴定

以质粒pUC-5BE为模板，利用引物5BE-F和5BE-R扩增带有酶切位点的5BE片段。PCR扩增采用50 μL反应体系：2×RapidTaqMaster Mix 25 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、质粒模板1 μL、ddH2O 20 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共33个循环；72 ℃终末延伸5 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

图2 PCR扩增5BE基因结果

采用PCR凝胶回收试剂盒，对PCR产物进行回收纯化。使用限制性内切酶BamHI和XhoI，对质粒pET-28a（+）和纯化的5BE片段进行双酶切。酶切产物不经凝胶分离，直接过柱回收。将双酶切后回收的5BE与载体pET-28a（+）连接。连接体系（10 μL）：5BE 2 μL、载体6 μL、连接酶缓冲液1 μL、T4连接酶 1 μL。16 ℃连接4 h后，将连接产物转化至TOP10感受态细胞，转化完成后涂布于含卡那抗性的LB平板上，37 ℃过夜培养。

挑取若干单菌落进行摇菌，待菌液摇混，取菌液1 μL作为模板，利用载体引物pET-28a-F和pET-28a-R进行PCR扩增，鉴定阳性菌液。将经PCR鉴定为阳性的菌液，送公司进行测序鉴定。

1.5 重组蛋白诱导表达

将测序鉴定正确无误的菌液以1:100比例接种至10 mL卡那抗性LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养。在菌液OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG使其浓度达到0.5 mmol/L，继续于37 ℃诱导培养6 h。离心收集诱导后的菌体沉淀，加入1 mL PBS重悬菌体，置于冰上进行超声波破碎。超声条件设为功率20%、超声2 s、停歇2 s、超声时长10 min。超声后，10 000 r/min，4 ℃离心10 min，分成上清和沉淀。将沉淀用1 mL PBS重悬，分别取超声后的全菌样品、离心后上清样品以及离心后重悬的沉淀样品各40 μL，加入10 μL 5×Loading Buffer，煮沸5 min，制备蛋白样品。最后进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，分析蛋白的表达情况。

1.6 蛋白纯化与鉴定

根据目的蛋白表达形式，采用康为世纪生物有限公司的可溶性His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白His-5BE，通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析蛋白纯度，利用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化的蛋白浓度。

1.7 实验动物与免疫

选取6周龄左右的BALB/c雌性小鼠3只，免疫前尾静脉采血，将采集血清作为阴性血清对照。将纯化的重组蛋白稀释至1 μg/μL，与等体积弗氏佐剂充分混合乳化，在小鼠颈背部皮下多点注射，按200 μL/只免疫（抗原100 μg/只）。每次免疫间隔3周，共免疫3次，第3次免疫后14 d尾静脉采血分离血清。

1.8 多克隆抗体效价测定

采用间接ELISA测定多克隆抗体效价。用碳酸盐缓冲液将纯化的重组蛋白His-5BE稀释至1 μg/mL，每孔100 μL包被ELISA板，4 ℃包被过夜；包被后，PBST洗涤3次，将100 μL含5%脱脂乳的PBS加入孔中，于37 ℃封闭2 h；封闭后，PBST洗涤3次，加入倍比稀释的血清（1:1 000～1:640 000），37 ℃反应1 h；PBST洗涤3次，然后加入1:5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次，每孔加入100 μL TMB底物溶液，避光反应5 min，加入终止液（2 mol/L H2SO4）100 μL/孔；最后在酶标仪上测定OD450，计算抗体效价。

1.9 多克隆抗体反应性鉴定

重组蛋白His-5BE经SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜上，用5%脱脂乳37 ℃封闭2 h；PBST洗涤3次，10 min/次（下同），将1:500稀释的5BE多抗血清作为一抗，于室温孵育NC膜2 h；PBST洗涤3次，以1:5 000稀释的HRP-羊抗鼠IgG作为二抗，于室温反应1 h；PBST洗涤3次，然后加入ECL发光液，置于曝膜仪显影拍照。

2 结果

2.1 5BE基因合成与重组载体构建

参照沈小芳[11]的研究结果，在BVDV NADL株E2蛋白上，选择与CSFV E2蛋白高度保守的5个抗原表位相对应的5个表位序列，分别命名为BVDV E1～5（表2）。将5个表位以氨基酸GSGS柔性串联（E1-E1-GSGS-E2-E2-GSGS-E3-E3-GSGS-E4-E4-GSGS-E5-E5，缩写为5BE，图1-A），5BE对应的基因序列如图1-B所示。5BE序列由公司合成，克隆到pUC载体上。

表2 BVDV NADL株E2蛋白的5个抗原表位

以pUC-5BE质粒为模板扩增出带有BamHI和XhoI酶切位点的5BE基因（图2）。通过传统的酶切连接方式，把5BE基因与原核表达载体pET-28a（+）连接；利用载体引物pET-28a-F和pET-28a-R，对连接转化所得的菌落进行PCR鉴定，将菌液鉴定阳性的克隆送公司进行序列测定。

测序结果（图3）表明，5BE被成功连入到pET-28a（+）载体的BamHI和XhoI位点之间，没有发生移码，且该克隆中的5BE基因与5BE原始基因对比，没有发生突变，重组载体pET-28a-5BE构建成功。

图3 重组质粒pET-28a-5BE测序鉴定结果

2.2 重组蛋白His-5BE表达与纯化

选取测序确证无误的克隆，从中提取质粒pET-28a-5BE，然后转化到表达感受态细胞BL21（DE3）。IPTG诱导表达后，将处理菌液分成全菌、上清、沉淀3种样品，进行SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色。从图4可以看出，与空载体pET-28a诱导表达产物相比，重组蛋白His-5BE获得表达，位于17～25 kD，与预期大小（22 kD）相符。His-5BE表达量较大，主要以包涵体形式存在，但在上清中也有部分表达。

图4 重组蛋白His-5BE的表达分析结果

由于部分重组蛋白His-5BE是可溶性表达，因此采用Ni柱亲和层析方式纯化带有His标签的目的蛋白。纯化后，通过蛋白电泳及考马斯亮蓝染色分析蛋白纯化效果。结果（图5）显示，纯化的His-5BE纯度较高，杂带较少，且目测蛋白浓度也较高。通过BCA法测得纯化蛋白的质量浓度达到1.54 mg/mL，能够满足免疫要求。

图5 纯化蛋白His-5BE考马斯亮蓝染色分析结果

2.3 5BE蛋白多克隆抗体ELISA效价测定

用建立的间接ELISA方法，对梯度稀释的多抗血清及阴性血清对照进行效价测定。结果（图6）显示：多抗血清1:1 000稀释时的OD450为3.68，而此稀释度下阴性血清的OD450仅为0.26；当多抗血清稀释至32万倍及以上时，多抗血清的OD逐渐接近阴性血清的OD，说明制备的His-5BE的多抗血清效价至少达到1:160 000。

图6 His-5BE蛋白多克隆抗体ELISA效价测定结果

2.4 5BE蛋白多抗血清Western Blot检测

为验证多抗血清的反应性及纯化蛋白纯度，以纯化的重组蛋白His-5BE为样品，以5BE蛋白多抗为一抗进行Western Blot检测。结果（图7）显示，在His-5BE预期位置，出现明显的特异性条带，说明制备的抗血清1:500稀释时具有良好的反应性。

图7 His-5BE蛋白多抗血清的Western Blot检测结果

3 讨论

BVDV宿主范围较广，包括牛、猪、羊、骆驼等动物[12]。牛群中BVDV血清抗体阳性率普遍很高，而且各地区流行的BVDV亚型各有不同，我国流行的以BVDV-1为主[10]。近年来，我国猪群中BVDV感染率逐渐升高。猪感染BVDV无明显临床症状或出现类似轻症猪瘟临床表现，但BVDV可引发仔猪持续性感染和免疫抑制，导致猪体免疫力下降，易诱发其他病原感染[13]。徐磊等[14]对福建省猪源BVDV流行与分布情况进行了批量检测，发现BVDV抗体阳性率为35.6%（5 891/16 537），400份样品中BVDV病原阳性率为15.3%，表明福建省猪源BVDV感染较普遍，且BVDV感染对CSFV抗体产生有抑制作用。近几年，我国多家研究单位从血清制品和生物制品中检测到BVDV污染，而诸如胎牛血清污染BVDV和细胞污染BVDV将给疫苗生产，特别是CSFV疫苗带来风险[15-17]。因此，在对猪进行CSFV检测的同时有必要进行BVDV检测。

E2蛋白是瘟病毒最主要的抗原蛋白，承载着BVDV与CSFV的主要抗原位点，同时E2蛋白保守性较低，其编码基因含有较多的变异位点，可作为BVDV分型的依据[2]。由于BVDV与CSFV有血清学交叉反应，常规血清学方法很难准确检测BVDV。为解决这一问题，拟制备E2蛋白的单克隆抗体，以E2蛋白特异性单抗来检测BVDV。为此，从BVDV E2蛋白上找到与CSFV E2上抗原表位差异较大的表位，将这些表位串联重复依次连接，采用原核表达系统表达、纯化重组蛋白His-5BE，以纯化的His-5BE蛋白作为免疫原，免疫小鼠制备多抗血清，并为单克隆抗体制备做准备。

本研究诱导表达的His-5BE主要存在于包涵体中，也有少量是可溶性表达。对上清中的His-5BE进行亲和层析纯化，将纯化的目的蛋白免疫小鼠制备了抗5BE多克隆抗体。以His-5BE为包被原，采用间接ELISA测得多抗血清的效价高达16万倍，且Western Blot试验也证实将该多抗稀释500倍，能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应，说明免疫His-5BE激发了BALB/c小鼠强烈的免疫应答。该研究为建立BVDV检测方法及后续制备单克隆抗体奠定了基础。