鸽A群轮状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

邢安琪，彭真奇，蒋文明，克军宏，4，李 阳，陈 璐，5，王静静，许立华，于晓慧，刘华雷

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.宁夏大学，宁夏银川 750021；3.安徽农业大学，安徽合肥 230036；4.塔里木大学，新疆阿拉尔 843300；5.山东农业大学，山东泰安 271018）

轮状病毒（rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus），是一种无囊膜、二十面体对称、双股正链RNA病毒[1-3]。RV基因组由11个分段的双链RNA片段组成，编码6种结构蛋白（VP1—VP4、VP6—VP7）以及6种非结构蛋白（NSP1—NSP6）[3-5]。RV结构蛋白在病毒复制、抗原特性保持、病毒基因分型中起到决定性作用，非结构蛋白影响病毒的毒力与复制过程[6-9]。根据VP6蛋白群特异性抗原决定簇差异，RV可分为10个种（群）（A—J），其中A群RV（group rotavirus A，RVA）是引起人类及多种畜禽急性脱水腹泻的重要病原体之一。

RVA是鸽群中一种常见的病原体，幼鸽感染后常出现腹泻、脱水等临床症状。1981年，RVA首次从比利时鸽群粪便中被检出，随后国外学者对鸽源RVA进行了众多研究[10-11]。1988年，日本学者Minamoto等[12]检测发现野鸽中RVA阳性率为32.4%，并首次从野鸽粪便中成功分离出两株RVA。Rubbenstroth等[13]对2010—2018年欧洲部分地区家鸽中RVA的感染情况进行调查，发现德国鸽舍RVA阳性率为51.56%，比利时为57.14%，丹麦高达100%。据报道[14]，2016—2017年澳大利亚鸽子RVA总个体阳性率达13.73%，推测在此期间存在被感染风险的鸽子数量达12 328只。我国对禽RVA的研究主要围绕鸡群的感染情况、病毒分子生物学特性等相关领域，而针对鸽RVA的相关研究较少[15-16]。

RVA检测主要依靠实验室，目前针对鸽RVA检测方法的研究较少。我国已报道利用高通量测序技术检测出鸽RV[17-18]，但该方法操作复杂、成本较高。为满足我国鸽RVA的检测需求，本研究针对RVAVP6基因设计特异性引物和探针，建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的实时荧光RT-PCR检测方法，以期为鸽RVA的临床快速检测和流行病学调查提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒和临床样品

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV，包括H5、H7、H9、H10亚型）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、鸽源冠状病毒（coronavirus，CoV）、鸽RVA、鸽腺病毒（pigeon adenovirus，PiAdV）、鸽圆环病毒（pigeon circovirus，PiCV）和鸽疱疹病毒（pigeon herpesvirus，PiHV），均由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存。

192份鸽口腔/泄殖腔拭子样品和8份鸽临床组织样品，均于2022年采自云南、广东、福建、江西、安徽、河北、山东等7个省，由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存。

1.2 主要试剂

Fine pure病毒DNA/RNA柱式提取试剂盒（离心柱型），购自GENFINE公司；PrimerScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 RT-PCR Kit、One Step PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time），购自TaKaRa公司；DNA Extraction Kit，购自Solarbio公司；TIANprep Mini Plasmid Kit，购自TIANGEN公司；RNeasy Mini Kit（50），购自QIAGEN公司；RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7，购自Promega公司。

1.3 样品处理

1.3.1 拭子样品 以10 000 r/min离心5 min，收取上清，-80 ℃保存备用。

1.3.2 病死鸽组织样品 剖检病死鸽，取适量的肝脏、脾脏等组织置于洁净的2.0 mL离心管内，按体积比1:3加入PBS及灭菌小钢珠，随后置于组织研磨机内充分研磨，反复冻融3次后，10 000 r/min离心5 min，收取上清，-80 ℃保存备用。

1.4 核酸提取

按照Fine pure病毒DNA/RNA柱式提取试剂盒（离心柱型）说明书，进行病毒DNA/RNA提取，将提取的DNA/RNA立即用于PCR扩增或者于-20 ℃保存。

1.5 cRNA标准品制备

1.5.1VP6基因重组质粒构建 针对鸽RVAVP6基因保守序列设计特异性引物（表1），以本实验室保存的鸽RVA阳性核酸为模板，进行RT-PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用Solarbio快速胶回收试剂盒对RT-PCR产物进行纯化回收，并克隆至pCI-neo载体，随后转化到Trans-109感受态细胞中，构建重组质粒，测序鉴定无误后提取细菌质粒。

表1 VP6基因目的片段扩增引物

1.5.2VP6基因体外转录 利用XbaI限制性内切酶对重组质粒进行酶切，经鉴定后利用DNA回收试剂盒对其进行纯化；取适量完全线性化的重组质粒，用RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录，最后用RneasyMiNi Kit试剂盒对体外转录产物进行纯化。cRNA标准品分装后于-80 ℃保存。

1.5.3 cRNA标准品浓度测定与拷贝数计算

1.5.3.1 浓度测定 对cRNA标准品进行10、100倍稀释后，利用Nano Drop核酸定量仪分别测量其浓度，若其浓度呈10倍梯度差则测量准确。

1.5.3.2 拷贝数计算 拷贝数（copies/µL）=（6.02×1023）×（ng/µL×10-9）/（DNA length×340）。

1.6 引物、探针设计与合成

参考GenBank中已公布的鸽RVAVP6基因序列（GenBank登录号D16329、MN481635、MK692882、OK185349、KX815083），利用Primer express分析软件，设计特异性引物和TaqMan探针（表2），引物与探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 荧光RT-PCR引物和探针

1.7 荧光RT-PCR反应体系优化

以cRNA标准品为模板，按照TaKaRa荧光RT-PCR试剂盒说明书配置反应体系，并在此基础上完成反应体系和退火温度的优化。

1.7.1 探针浓度优化 固定反应体系中引物终浓度不变，分别加入0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L终浓度的探针进行试验，根据荧光RT-PCR的最低检出限确定最优探针浓度。

1.7.2 退火温度优化 在加入探针浓度为最佳且其他反应条件固定不变的情况下，将退火温度分别设置为58、59、60、61 ℃进行试验，每个温度做3个重复，通过比较不同退火温度下的Ct值确定最佳退火温度。

1.8 标准曲线建立

将cRNA标准品进行10倍倍比稀释，选取5个浓度梯度，进行荧光RT-PCR试验，以获得的Ct值为Y轴，cRNA标准品的浓度为X轴，绘制标准曲线。

1.9 特异性试验

以鸽群常见的CoV、NDV、AIV、PiCV、PiHV、PiAdV、RVA阳性核酸为模板，进行荧光RT-PCR扩增，评价该方法的特异性。

1.10 灵敏度试验

将鸽RVA cRNA标准品进行10倍倍比稀释，选取不同的稀释度进行荧光RT-PCR扩增，每个稀释度做3份重复。根据相关研究[19]合成RVA常规RT-PCR检测引物，同时对上述模板进行常规RT-PCR，用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，预期扩增片段长度为396 bp。根据结果评价该方法的灵敏度。

1.11 重复性试验

选取5个浓度梯度的cRNA标准品，用同批次配置的荧光RT-PCR反应体系进行检测，重复3次，计算组内重复变异系数（CV）；用不同批次配置的荧光RT-PCR反应体系进行检测，重复3次，计算组间重复CV。

1.12 临床样品检测

利用本研究建立的鸽RVA荧光RT-PCR检测方法，对192份鸽拭子样品和8份鸽病料样品进行检测，同时用常规RT-PCR方法进行平行检测，并对两种检测方法的结果进行比较。

2 结果

2.1 cRNA标准品制备

以鸽源RVA核酸为模板，RT-PCR扩增VP6基因片段，扩增产物经纯化回收后克隆至pCI-neo载体，构建了重组质粒pCI-VP6。利用XbaI限制性内切酶对重组质粒进行酶切，使其线性化，目的条带约为7 472 bp（图1）。将完全线性化的标准质粒pCI-VP6经体外转录纯化后获得cRNA标准品，利用公式计算cRNA标准品的拷贝数为7.22×1012copies/µL。

图1 标准质粒pCI-VP6的PCR鉴定结果

2.2 荧光RT-PCR反应体系优化

2.2.1 探针浓度优化 保证其他反应体系不变，以7.22×106～7.22×101copies/µL的cRNA标准品为模板，使用不同终浓度的探针进行荧光RT-PCR检测。结果（图2）显示，0.15 mmol/L探针的检测下限为7.22×103copies/µL，0.20～0.30 mmol/L探针的检测下限均为7.22×102copies/µL，故探针浓度选择0.20 mmol/L。

图2 不同浓度探针最低检测限的比较结果

2.2.2 退火温度优化 以7.22×106copies/µL的cRNA标准品为模板，在其他条件不变的情况下将退火温度分别设置为58、59、60、61 ℃进行荧光RT-PCR，每个温度做3次重复，各Ct值见表3。根据结果，最终选择最佳退火温度为60 ℃。

表3 荧光RT-PCR退火温度优化结果

2.2.3 反应体系及条件确定 最终确定的一步法实时荧光RT-PCR反应体系如表4所示。最佳反应条件：42 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃35 s，40个循环。

2.3 标准曲线建立

将cRNA标准品进行10倍倍比稀释，取7.22×（108～104）copies/µL浓度为模板，进行荧光RT-PCR反应，绘制标准曲线（图3）。标准曲线中Ct值和cRNA标准品拷贝数之间呈现良好的线性关系，获得的曲线方程为Y= -4.252X+15.852，相关系数R2为0.998。

图3 鸽源RVA荧光RT-PCR标准曲线

2.4 特异性试验

用鸽群7种常见的病毒核酸进行特异性试验。结果（图4）显示，只有鸽RVA核酸出现特异性扩增曲线，而建立的方法与其他鸽群常见病毒核酸无交叉反应，表明特异性良好。

图4 鸽源RVA荧光RT-PCR特异性试验结果

2.5 灵敏度试验

以不同稀释倍数的cRNA标准品为模板，进行灵敏度试验。结果显示，本研究建立的实时荧光RTPCR方法的最低检测限为7.22×102copies/µL（图5），而常规RT-PCR最低检测限为7.22×104copies/µL（图6）。RVA荧光RT-PCR检测方法的灵敏度比常规RT-PCR高100倍。

图5 鸽源RVA荧光RT-PCR灵敏度试验结果

图6 鸽源RVA常规RT-PCR灵敏度试验结果

2.6 重复性试验

结果（表5～6）显示，该检测方法各稀释度标准品的组内重复CV为0.21%～0.91%，组间重复CV为0.28%～1.44%。组内重复CV均小于1%，组间重复CV均小于1.5%，说明该检测方法具有良好的重复性。

表5 鸽源RVA荧光RT-PCR组内重复试验结果

表6 鸽源RVA荧光RT-PCR组间重复试验结果

2.7 临床样品检测

利用本研究建立的实时荧光RT-PCR方法，对200份临床样品进行检测，结果检出37份阳性样品，阳性率为18.50%，而用常规RT-PCR方法从上述样品中检出25份阳性样品，阳性率为12.50%，两种方法的符合率为94.00%，Kappa值为0.773（表7）。

表7 RVA荧光RT-PCR与常规RT-PCR检测法检测结果比对 单位：份

3 讨论

近年来，随着我国养鸽业产业化、规模化、自动化发展，鸽子饲养数量逐年增加，饲养地区越加广泛，人们对鸽群中存在的相关疫病愈加重视。RV是鸽群中一种常见病原体，当鸽群感染RVA时，病鸽主要表现脱水、腹泻、增重减慢等临床症状。RVA可经粪-口传播，这使规模化鸽场存在大流行风险，尤其当与其他病原存在混合感染时，则会导致鸽群死亡率升高，严重影响鸽群生产力，阻碍养鸽产业发展[20]。

针对病原的早期检测是控制鸽群RV大规模感染和传播的关键[19]。目前临床上已有基于禽源RVA的多种检测方法，其中在电镜下观察细胞中存在的病毒粒子最为直观，但该方法中样品的处理环节较为繁琐；免疫荧光技术和RT-PCR技术是目前较为常用的检测技术，但均要求检测样本中的病毒载量较高，因此灵敏度相对较差；高通量测序技术成本相对较高，后续基因组序列拼接过程较为繁琐；此外，基于禽源RVA建立的检测方法对鸽源RVA敏感性不强。因此，亟需建立针对鸽群RVA的快速、灵敏、特异、准确的检测方法，以期为开展鸽源RVA的早期检测提供技术支持。

本研究基于鸽RVAVP6基因保守序列设计特异性引物及探针，并对其反应体系及反应条件进行优化，建立了鸽RVA实时荧光RT-PCR检测方法。本研究中使用的标准品是经过体外转录过程合成的cRNA，具有良好的稳定性和灵敏度，提高了对样品处理以及逆转录过程的控制，为检测方法的稳定提供了基础[21]。特异性、灵敏度试验结果显示，该检测方法特异性良好，只有鸽RVA核酸出现特异性扩增曲线；灵敏度高，最低检测限为7.22×102copies/µL，比常规RT-PCR灵敏100倍；重复性试验中组内重复CV为0.21%～0.91%，组间重复CV为0.28%～1.44%，均小于1.5%，提示该检测方法的可重复性好。

利用本研究建立的RVA实时荧光RT-PCR方法与常规RT-PCR方法，同时对200份临床疑似鸽RVA感染样品进行检测，发现两种方法的符合率为94.00%，且实时荧光RT-PCR阳性率（18.50%）高于常规RT-PCR（12.50%），提示本研究所建立的RVA检测法与临床上常用的检测法一致性良好，且灵敏度更高，具有良好的临床诊断性能。综上所述，本研究建立了一种快速、敏感、特异、准确的鸽RVA实时荧光RT-PCR检测方法，为鸽RVA感染的早期诊断及综合防控提供了必要的技术支持。