miR-494-3p 在胃癌患者血清外泌体中的表达及价值*

李金昌，王俊壹，张其德，顾万建（江苏省中医院.检验科，.肿瘤科，.消化内镜中心，南京 210029）

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，每年新发胃癌病例中早期胃癌占比仅为20%，多数发现时已至进展期，总体5 年生存率不足50%［1］。为提高早期诊断水平，无创、方便快捷、便于大规模筛查的血清学新型肿瘤标志物有待被发现和应用。近年来报道，血清外泌体miRNAs 有望作为肿瘤诊断的候选生物学标志物［2］。miR-494-3p 在多种肿瘤中异常表达，发挥着不同的调控作用，例如其在肝细胞癌组织中呈高表达，并可通过调控脂质生物合成促进肝癌细胞的生长和转移［3］；miR-494-3p 在结直肠癌组织和细胞系中呈低表达，且低表达患者的生存率较低［4］。研究表明，前体miR-494 在胃癌组织中呈低表达，并对胃癌细胞具有抑制作用［5］；但关于miR-494-3p 在胃癌组织及其血清外泌体中的研究鲜见报道。本研究旨在检测miR-494-3p 在胃癌患者组织和血清外泌体中的表达水平，并分析其对胃癌筛查及辅助鉴别诊断的价值。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 选取2019 年1 月至2021 年12 月江苏省中医院消化内镜中心就诊的胃癌患者经手术切除的新鲜胃癌组织14 例作为胃癌组，其中男9例，女5 例，年龄（64.6±6.8）岁，Ⅰ／Ⅱ期6 例，Ⅲ期8例，肿瘤大小＞3 cm 7 例，≤3 cm 7 例；收集同期因胃炎或胃息肉等胃部良性疾病行胃镜活检的新鲜胃组织16 例作为相关疾病对照组，其中男4 例，女12 例，年龄（46.9±11.7）岁；另收集同期门诊就诊的44 例胃癌患者的血清标本，其中男32 例，女12 例，年龄（67.9±7.9）岁；以及同期体检健康者的血清标本，其中男32 例，女12 例，年龄（68.0±7.9）岁。胃癌组纳入标准：（1）胃癌组织样本为手术切除且经病理组织学明确诊断，患者术前未经放化疗治疗；（2）胃癌血清样本来源为本院门诊就诊的胃癌患者（经本院或他院内镜或活检确诊），收集血清时未经放化疗或手术治疗。胃癌组排除标准：（1）合并其他良恶性肿瘤；（2）合并免疫系统疾病；（3）合并心肝肾严重功能不全；（4）样本取样量少、溶血等样本不符合实验要求。胃癌患者诊断和分期符合胃癌诊疗指南（2022 年版）［1］。本研究通过南京中医药大学附属医院（江苏省中医院）伦理委员会审核批准（2018NL-KS18），研究对象均知情同意。

1.2 主要仪器和试剂 ExoQuickTMExosome Isolation Reagent（EXOQ5A-1）血清外泌体提取试剂盒（美国SBI 公司），QuantstudioTMDX 定量PCR 仪、TRlzol 试剂、Taqman 探针法PCR 预混液、TaqmanTMmiRNA assay（hsa-miR-494-3p／hsa-miR-16／cel-miR-39探针引物设计与合成）购自美国ABI 公司，外参线虫cel-miR-39（序列为UCACCGGUGUAAAUCAGCU UG，南京瑞真生物公司），反转录试剂（日本TaKaRa公司），NanoDrop2000 微量分光光度计（美国Thermo Fisher 公司），氯仿、无水乙醇（上海久亿化学试剂有限公司），无核酶水（南京凯基生物公司）。

1.3 组织总RNA 提取 取-80 ℃冷冻保存的组织块，称取约50 mg，用干净消毒的剪刀剪碎，加入TRlzol 试剂裂解后，按照说明书采用氯仿、无水乙醇等提取总RNA，提取的总RNA 溶解于20 μL 无核酶水，NanoDrop2000 微量分光光度计检测RNA纯度和浓度，取吸光度（A260nm／A280nm）值在1.8～2.0之间且浓度＞25 μg／μL 的样本用于后续试验，样本置于-80 ℃保存。

1.4 血清外泌体的提取、鉴定及外泌体RNA 的提取 按照SBI 外泌体提取试剂盒说明书进行外泌体提取，取冷冻保存的血清样本恢复至室温，3 000×g离心15 min 去除细胞和碎片，在干净无菌的1.5 mL 离心管中加入200 μL 血清和50 μL 外泌体提取试剂充分颠倒混匀，4 ℃静置30 min，1 500×g离心30 min 后弃上清液，1 500×g离心5 min 后用移液器轻轻吸去残余上清液，底部沉淀即为获取的外泌体，用200 μL 无核酶水溶解，4 ℃短时间冷藏保存，用于后续试验。重悬的外泌体溶液外送至南京中镜科仪技术有限公司用于透射电镜拍摄和粒径分析以鉴定外泌体。外泌体悬液中加入等量TRlzol 试剂裂解，每份样本加入1 μL 线虫cel-miR-39（工作浓度20 nmol／L）作为外部参照，后续按TRlzol 试剂说明书提取总RNA（纯度和浓度的检测、样本要求及保存条件同上述组织样本）。

1.5 反转录和PCR 扩增 对于上述提取的总RNA，采用Taqman 探针法，按照TaKaRa 反转录试剂盒说明书操作，将RNA 反转录成cDNA。按照ABI 定量PCR 试剂盒和QuantstudioTMDX 定量PCR 仪说明书进行PCR 扩增。探针法qPCR 反应体系为20 μL，包括：PCR Mix 预混液10 μL，TaqMan酶1 μL，反转录cDNA 2 μL，无核酶水7 μL。qPCR 反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，45 个循环。采用QuantstudioTMDX 定量PCR 仪自带分析软件于60 ℃时收集荧光信号并进行熔解曲线分析，自动计算循环阈值（Ct）。组织样本后续qPCR 以has-miR-16作为内部参照，血清样本后续qPCR 以线虫cel-miR-39 作为外部参照，miR-494-3p 的相对表达水平通过内参或者外参标准化后，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，ΔΔCt＝（Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组，每个样本重复检测3 次，取均值Ct。

1.6 统计学分析 采用Graphpad prism 8.0 软件作图，SPSS 23.0 统计学软件进行统计分析。数据进行正态分布检验符合正态分布，基因表达量用表示，各组数据比较前均进行方差齐性检验，符合方差齐性的两组均值比较采用独立样本t检验（双尾），方差不齐的两组数据差异比较采用非参数检验中的Mann-WhitneyU秩和检验。采用ROC 曲线分析并评估目标基因对疾病的诊断效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌患者和健康人对照组血清外泌体miR-494-3p的相对表达水平比较 与健康人对照组（1.00±0.36）相比，胃癌组血清外泌体miR-494-3p 的相对表达水平（0.21±0.03）降低，差异有统计学意义（Z＝3.64，P＜0.01）；胃癌患者血清外泌体miR-494-3p的表达水平在不同性别组（男性组和女性组分别为0.25±0.04 和0.12±0.03，t＝1.91，P＝0.06）、年龄组（＜70 岁组和≥70 岁组分别为0.23±0.04 和0.19±0.04，t＝0.75，P＝0.46）间的差异无统计学意义。

2.2 血清外泌体miR-494-3p 筛查胃癌的ROC 曲线分析结果 以44 例胃癌患者作为疾病组，44 例健康人作为对照组，根据血清外泌体miR-494-3p的结果绘制ROC 曲线，血清外泌体miR-494-3p 筛查胃癌和健康人的ROC 曲线下面积（AUCROC）为0.725（95%CI：0.622～0.829，P＜0.01），最大约登指数为0.364，当cut-off 值为0.370 时，敏感性为50.0%，特异性为86.4%，阳性预测值为63.3%，阴性预测值为78.6%，准确性为68.2%，见图1。

图1 血清外泌体miR-494-3p 筛查胃癌和健康人的ROC 曲线

2.3 胃癌组和相关疾病对照组组织中miR-494-3p的表达水平比较 与相关疾病对照组组织中miR-494-3p的相对表达水平（1.00±0.39）相比，胃癌患者组织中miR-494-3p 的相对表达水平（0.22±0.07）显著降低，差异有统计学意义（Z＝2.66，P＜0.01）。

2.4 胃癌患者组织中miR-494-3p 表达水平与临床病理参数的关系 胃癌患者组织中miR-494-3p 的表达水平在不同性别、年龄、肿瘤浸润、淋巴转移、肿瘤大小、肿瘤分期亚组中的差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 胃癌患者组织中miR-494-3p 表达水平与临床病理参数的关系

3 讨论

miR-494-3p 前体是位于14 号染色体上的miR-494，miR-494-3p 在多种肿瘤中异常表达，但在不同肿瘤中发挥的作用不同，通过相应的调控机制发挥癌基因［3，8］或者抑癌基因［4］作用，也可参与调控肿瘤耐药［6］。早在2014 年有文献［7］报道，miR-494在胃癌中通过靶向c-myc 发挥抑癌基因作用，在胃癌组织和细胞中的表达水平降低，且与不良预后相关；该作者通过小鼠实验进一步证实miR-494 对胃癌具有抑制作用。近年来，国内文献［5］也表明miR-494 在胃癌组织中的表达水平显著降低，过表达miR-494 可以抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。本研究结果显示，相较于胃良性疾病组织，胃癌组织中miR-494-3p 的表达水平显著降低（P＜0.05），这与上述文献［5，7］报道的其前体miR-494在胃癌组织和细胞中表达水平降低的结论相符。另据一项肺癌的研究［8］表明，组织中前体miR-494 的表达水平与成熟体miR-494-3p 水平存在直接相关性，故而在一定程度上证实miR-494-3p 在胃癌中也可能发挥着抑癌基因的作用。然而，本研究结果显示胃癌患者组织中miR-494-3p 的表达水平在不同肿瘤分期、淋巴转移亚组中未见显著差异，这与文献［7］中发现miR-494存在显著差异的结果不符，分析原因可能与本研究纳入的胃癌组织样本数较少导致亚组分析代表性不强有关，后续有待扩大样本量进一步研究。有文献报道，肿瘤患者miR-494-3p的表达水平与对应的circRNA 呈负相关，miR-494-3p 表达水平降低可能与其作为环状RNA 的靶点而发挥海绵作用有关，例如Circ_0007142 通过海绵miR-494-3p参与调节食管癌的耐药［6］，Circ_0000745 还可通过海绵miR-494-3p 调控miR-494-3p／NET1 轴，促进急性淋巴细胞白血病的进展［9］。本研究尚未进行胃癌中miR-494-3p 功能机制的研究，后续有待进一步探究。

本研究发现胃癌患者血清外泌体中miR-494-3p的相对表达水平显著低于健康人对照组（P＜0.05），这与本研究胃癌组织中miR-494-3p 的表达水平降低一致，且与文献报道胃癌患者血浆miR-494水平降低［9］及胃癌组织和细胞中miR-494表达降低［5，7］相符。上述结果表明，胃癌患者血清外泌体中miR-494-3p 水平可以反映其在胃癌肿瘤组织中的表达水平，这为应用于无创的血清学肿瘤标志物检测胃癌提供了实验依据。血清外泌体可能来源于肿瘤组织亲本细胞的释放，且在外泌体脂质膜的富集和保护下，外泌体中miRNAs 信息在一定程度上能反映肿瘤组织的生物学信息，比血清或者血浆游离miRNAs 在液体活检中发挥肿瘤标志物作用方面更有意义。本研究中血清外泌体miR-494-3p区分胃癌患者和健康人的ROC 曲线下面积为0.725（95%CI：0.622～0.829，P＜0.01），当cut-off 值为0.370 时，敏感性为50.0%，特异性为86.4%，阳性预测值为63.3%，阴性预测值为78.6%，准确性为68.2%，说明血清外泌体miR-494-3p 对胃癌具有一定的筛查价值。本研究数据表明该指标特异性尚可，但敏感性不高，故不宜单独用于胃癌诊断，可结合传统肿瘤标志物或影像学检查等其他检查指标，作为未来潜在的胃癌筛查和辅助诊断生物学标志物。