江苏地区水禽源主要细菌病流行情况调查分析

顾陈怡，董洪燕，郭长明，封琦，谢军，宋海港，吴植

（ 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300 ）

中国是水禽生产大国，饲养量占世界总量的70%，肉鸭、蛋鸭及肉鹅产业的产值均呈稳定增加态势[1-2]。但随着饲养规模化程度不断提高，饲养密度不断增大，水禽养殖中许多疫病不断发生，尤其是细菌感染已成为制约水禽产业快速发展的重要影响因素。大肠杆菌病、沙门氏菌病和鸭疫里氏杆菌病是当前危害水禽养殖业的主要细菌疾病。在商品代水禽场，大肠杆菌、沙门氏菌和鸭疫里氏杆菌感染所导致的病理变化较相似，以“三炎”即心包炎、肝周炎和气囊炎为主。在种水禽场，大肠杆菌病导致的危害更大，常导致患病禽类关节肿大、产蛋率下降和死淘率上升。有调查指出，细菌感染严重会导致水禽发病死亡[3-5]。

江苏是水禽养殖大省，但水禽疫病的控制形势不容乐观。当前对水禽细菌性疾病的流行情况、血清型分型、耐药基因和毒力基因的携带情况等均缺乏系统调查研究，加之部分地区药物敏感性监测尚不完善，因而造成抗生素药物的不规范使用，在生产养殖中给水禽细菌病的预防和控制带来了严峻的挑战。基于此，本研究依托江苏省现代农业（水禽）产业技术体系，对江苏全省范围内水禽源常见细菌病开展流行现状的调研与分析，以期为江苏地区水禽细菌性疾病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2021—2022年共采集江苏省10个地级市64个水禽养殖场的样品768份，主要包括肛拭子和组织样品两种类型。

肛拭子的采集对象为临床健康水禽，用灭菌的脱脂棉棒插入肛门2～4 cm处，在肛门口内轻轻旋转涂擦。

组织样品采集对象为剖检具有典型腹膜炎、心包炎、肝周炎和气囊炎等病理变化的水禽，无菌采集肝脏、心脏、肺脏等组织。将棉棒或组织分别放入盛有TSB培养基（需氧增菌培养）和TSB+石蜡培养基（厌氧增菌培养）的指形管中保存，依次编号记录，带回实验室。详细记录养殖场的性质、水禽的日龄、免疫程序、发病情况和药物使用等背景资料。

1.2 主要试剂

50×TAE、细菌DNA模板提取试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司；琼脂糖、DL2000 DNA Marker、PCR产物回收试剂盒购自大连宝生物公司；胎牛血清购自Gibico公司；DNA凝胶回收试剂盒购自康宁公司；布氏培养基、肉汤培养基、牛肉浸粉等购自青岛海博生物技术有限公司；优质琼脂糖购自西班牙Bio-west。

1.3 仪器设备

SW-CJ-1F净化工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、IS-RDS3摇床（广州深华生物技术有限公司）、TGL-16B台式冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、9902 PCR基因扩增仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）、DDY-6C电泳仪（北京六一仪器厂）、Tanon-2500凝胶成像系统（上海天能公司）等。

1.4 PCR引物设计与合成

参考相关文献[6-8]分别合成大肠杆菌fimA、沙门氏菌stn、鸭疫里氏杆菌OmpA特异性引物用于PCR检测，引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，引物序列信息具体见表1。

1.5 临床样品处理

将无菌采集的肛拭子和组织样品立即放置于37 ℃、220 r/min的摇床上培养12～24 h。采用煮沸法提取细菌的DNA模板，吸取0.8～1.0 mL菌体培养液于指形管中，12 000 r/min离心3～5 min，弃上清；菌体沉淀重新悬浮于1 mL的ddH2O中，12 000 r/min离心3～5 min，再次弃上清；菌体沉淀重新悬浮于200 μL的ddH2O中，用100 ℃沸水煮沸10 min后，再0 ℃冰浴5 min，之后12 000 r/min离心8～10 min，吸取的上清液即为细菌DNA，转移至新的指形管中并于-20 ℃保存。

1.6 临床样品PCR检测

以分别提取的DNA为模板，分别按照参考文献建立的PCR的体系和反应程序，利用设计的引物对大肠杆菌fimA、沙门氏菌stn、鸭疫里氏杆菌OmpA引物进行PCR快速检测。

PCR扩增体系（共20 μL）：细菌DNA模板2 μL、Primer-F 0.5 μL、Primer-R 0.5 μL、Premix Taq 10 μL、无菌水7 μL。

PCR检测扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃/55 ℃/58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃下延伸10 min，降温至4 ℃保存。

取5 μL PCR产物进1.2%琼脂糖凝胶电泳，以DL2000 为DNA Marker，Goldview染色后，在琼脂糖凝胶电泳成像系统上观察其扩增情况，出现与预期目的片段大小的计为阳性，依据阳性样品数与样品检测总数分别计算大肠杆菌fimA、沙门氏菌stn、鸭疫里氏杆菌OmpA等基因的检出率。

2 结果与分析

2.1 样品来源（见图1）

图1 样品来源Fig.1 Sample source

由图1可知，本调查共采集来自江苏省10个地级市64个水禽养殖场的样品768份，其中肛拭子样品510份，组织样品258份。

2.2 江苏地区水禽大肠杆菌F1菌毛基因fimA检出率（见图2）

图2 江苏地区水禽大肠杆菌F1菌毛基因fimA检出率Fig.2 Detection rate of F1 fimA gene of Escherichia coli in waterfowl in Jiangsu Province

由图2可知，大肠杆菌F1菌毛基因fimA的平均检出率为74.21%（570/768），其中肛拭子样品的平均检出率为70.58%（360/510），组织样品的平均检出率为81.40%（210/258）。泰州地区的肛拭子和组织样品F1菌毛fimA基因检出率均为最高，分别为86.05%、86.84%。

2.3 江苏地区水禽沙门氏菌stn基因检出率（见图3）

图3 江苏地区水禽沙门氏菌stn基因检出率Fig.3 Detection rate of stn gene of Salmonella in waterfowl in Jiangsu Province

由图3可知，沙门氏菌stn基因的平均检出率为5.60%（43/768），其中肛拭子样品的平均检出率为2.75%（14/510），组织样品的平均检出率11.24%（29/258）。连云港地区肛拭子和组织样品中沙门氏菌stn基因检出率均为最高，分别为5.13%（2/39）、33.33%（6/18）。

2.4 江苏地区水禽鸭疫里氏杆菌OmpA基因检出率（见图4）

图4 江苏地区水禽鸭疫里氏杆菌OmpA基因检出率Fig.4 Detection rate of OmpA gene of Riesiella pestipestii in waterfowl in Jiangsu Province

由图4可知，鸭疫里氏杆菌OmpA基因平均检出率为2.73%（21/768），其中肛拭子样品的平均检出率为9.52%（2/21），组织样品的平均检出率7.36%（19/285）。徐州地区的组织样品OmpA基因检出率最高为20.83%；而各地区肛拭子的检出率均较低，从0～1.64%不等。

3 讨论

禽致病性大肠杆菌（avian pathogenicE. coli）是导致水禽感染或继发感染死亡率最高的一类细菌病，可垂直传播[6-8]。水禽因感染禽致病性大肠杆菌死亡常见的临床特征有：大肠杆菌蜂窝织炎、传染性腹膜炎、败血症、心包炎、纤维蛋白性肝周炎、气囊炎、肠道盲肠炎、骨髓炎、关节炎、脑膜炎、大肠杆菌性肉芽肿、大肠杆菌脐炎等[9-10]。禽致病性大肠杆菌分离株血清型种类呈现多样化，如郭长明等[11]从国内20个地区的水禽中分离得到24株肠道外致病性大肠杆菌，主要的血清型有O1、O2、O18等。徐亚亚等[12]临床分离鉴定出120株禽致病性大肠杆菌，主要血清型包括O78、O18、O24和O88等。

鸭疫里氏杆菌（Riemrella anatipestifer）主要感染2～3周龄的雏鸭，以纤维素性心包炎、气囊炎、肝周炎、脑膜炎和关节炎为主要临床特征[13-14]。鸭疫里氏杆菌传染性强、致死率高，目前已成为危害鸭场最重要的传染病之一[15]。鸭疫里氏杆菌血清型众多且复杂，国际公认已分离鉴定出21个血清型，且仍有新的血清型不断被发现。目前不同血清型之间缺乏交叉保护，对鸭疫里氏杆菌的临床诊断和疫苗防控造成极大的困难[16-17]。

沙门氏菌病又称副伤寒，是由致病性沙门氏菌感染引起的一类细菌性传染性疾病。近年来，随着鸭、鹅养殖数量和养殖规模不断提高，沙门氏菌病发病率也呈逐年升高趋势，对水禽养殖业造成的危害和带来经济损失也越来越大[18]。由于沙门氏菌的感染途径多样化，若养殖管理不当，会造成沙门氏菌在整个养殖领域快速传播，进而导致群体净化处理耗时延长。

大肠杆菌、沙门氏菌和鸭疫里氏杆菌感染是危害水禽养殖业的主要细菌病。本试验在PCR快速检测的过程中，均选取了参考菌株作为对照，保证了检测结果的特异性和准确性。大肠杆菌F1菌毛fimA基因的平均检出率分为74.21%（570/768）；沙门氏菌stn基因平均检出率为5.60%（43/768）；鸭疫里氏杆菌OmpA基因平均检出率为2.73%（21/768），表明江苏地区水禽细菌性疾病中大肠杆菌的检出率最高。在商品代水禽养殖场，这3种细菌病引起的临床症状和病理变化较相似，需进一步通过细菌的分离鉴定及PCR检测进行鉴别诊断。在种鸭场、种鹅场，大肠杆菌的发病率更高，通常可引起卵黄性腹膜炎、关节炎和脚蹼炎症等，这与本试验中PCR检测的结果相符。本研究结果，由于水禽养殖规模化程度不断地提高，大肠杆菌、沙门氏菌及鸭疫里氏杆菌感染无明显的季节性。

4 结论

近年来，水禽疫病呈现多种病原混合感染或继发感染的现象，使大肠杆菌、沙门氏菌及鸭疫里氏杆菌感染等细菌病的情况更加复杂。本研究初步分析了江苏地区水禽源细菌病主要流行情况，可为今后水禽细菌病的综合防控提供参考。