发酵沙棘原果汁的乳酸菌筛选及工艺优化

毛新亮，王憬，周明，陆路，张新雪，付少委*

（1.完美（广东）日用品有限公司，广东中山 528400）（2.广东完美生命健康科技研究院有限公司，广东中山528400）（3.中国食品发酵工业研究院有限公司北京市蛋白功能肽技术研究中心，北京 100015）

我国是世界上沙棘资源最为丰富的国家[1]，在全国各地都有分布[2]。沙棘是药食同源植物[3]，具有极高的营养价值和药用价值[4]，其果实含有丰富的营养成分和生物活性物质[5]，已报道的活性成分约190多种，包括维生素和黄酮等[6]。沙棘黄酮有很高的保健和药用价值，具有降低心血管疾病[7]、抗氧化[8]、抗衰老[9]、抗疲劳、抗肿瘤、抗菌、降血脂、降血糖[10]等作用[11]。大部分黄酮在植物体内以糖苷形式存在，仅有小部分以游离苷元形式存在[12]。研究表明，黄酮糖苷在人体内生物利用度低于黄酮苷元[13]，黄酮糖苷所具有的功能活性作用，多依赖于其去除糖基后的黄酮苷元[14]。糖苷形式的黄酮类物质难以被人体胃肠道直接吸收[15]，只有在肠道菌群的作用下，黄酮苷可以通过微生物转化生成黄酮苷元，易于被人体吸收、利用[16]。微生物细胞中存在的酶种类较多，且具有较好的糖苷类化合物转化为苷元的潜力[17,18]，可以将黄酮类化合物以去糖基化反应、脱羟基化反应等方式转化为黄酮苷元，提高其生物利用度[14]。乳酸菌发酵被认为是一种保持并提高果蔬营养价值及感官特性的加工方法[19,20]，而目前关于乳酸菌显著提高沙棘原果汁黄酮的研究鲜有报道，且关于多个菌株复合进行黄酮苷转化黄酮苷元的研究也比较少见。

本研究以沙棘原果汁为原料，3种实验室自行保藏鉴定的乳酸菌作为发酵剂，采用微生物发酵技术提高沙棘原果汁中黄酮类物质的含量，利用高效液相色谱法检测其中黄酮类物质的含量，并通过单因素和正交试验，对其发酵工艺条件进行优化，得到最佳发酵工艺手段。目的是高效利用沙棘中的主要活性物质，提供优质发酵菌种资源以及多种黄酮类物质高效液相检测的方法，以期为沙棘黄酮类物质的研究提供参考、为中国沙棘工业产业化加工提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

沙棘原果汁，张北宝得康食品有限公司；菌种，所有菌种均来自实验室内自行鉴定保藏；MRS培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；山奈素、异鼠李素、槲皮素、金丝桃苷，纯度均≥98%，成都植标化纯生物技术有限公司；异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷，纯度均≥98%，武汉格林特生物技术有限公司；异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷，纯度均≥98%，宝鸡市辰光生物科技有限公司；异鼠李素-3-O-芸香糖苷、异槲皮苷，纯度均≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司；芦丁，纯度均≥98%，中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈（色谱纯），德国Merck；甲酸（色谱纯），迪马科技；试验用超纯水（18.2 MΩ·cm）由Milli-Q纯水系统制备。S20P型pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；1389A2型生物安全柜，美国Thermo；HZQ-211C型恒温震荡培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；水浴锅，苏州珀瓦尔实验设备有限公司；NexeraX2超高效液相色谱仪，岛津（上海）实验器材有限公司；XS205DU型分析天平，美国Mettler Toledo；QL-901型涡旋混合仪，中国其林贝尔仪器制造有限公司；BXM-50VE立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酮类化合物的检测

11种黄酮类化合物的高效液相色谱条件依照Chen等[21]的方法，在此基础上略有改动：色谱柱为Ascentis RP-Amide 15 cm×4.6 mm，3 μm；流动相为A相-乙腈+0.3%磷酸（V/V）；B相-乙腈+水（2.5+97.5）（V/V），用磷酸调节流动相至pH值3；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；进样量：50 μL。

1.2.2 沙棘原果汁发酵工艺流程

沙棘原果汁发酵的工艺流程如图1所示。

图1 沙棘原果汁发酵工艺流程Fig.1 Fermentation process of seabuckthorn juice

1.2.3 菌种复苏及培养

菌种保藏于-80 ℃，室温解冻，以1%（V/V）的接种比例接种于液体培养基中，（36±1）℃条件下培养24 h，活化2代备用。

1.2.4 沙棘前处理

称取一定体积的沙棘原果汁，利用小麦肽和碳酸钠调节沙棘原果汁的pH值，分装并在115 ℃下灭菌20 min。

1.2.5 菌株筛选

单一菌株筛选：选择唾液乳杆菌、戊糖片球菌、副干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌以及植物乳植物杆菌等共26个菌株进行单一菌株筛选实验。碳源添加量为4%（m/V），调节pH值为5，接种量为1%（V/V），于30 ℃下发酵5 d。

复配菌株筛选：根据单一菌株发酵后异鼠李素的含量，选择发酵效果显著的菌株，进行复配实验研究。共设计15组方案进行实验，碳源添加量为4%（m/V），调节pH值为5，接种量为1%（V/V），于30 ℃下发酵14 d，选择发酵后异鼠李素的含量最高的菌株复配组合，确定发酵终点。

1.2.6 工艺优化

针对发酵前后异鼠李素含量变化较高的菌种组合进行单因素实验设计，分别对温度、pH值、碳源添加量以及菌种组合的接种比例进行考察，探究相关因素对发酵过程中沙棘原果汁中异鼠李素含量（mg/L）的影响，确定各因素合适的发条件，为沙棘中异鼠李素含量的提高提供参考，每个因素设置3个平行（见表1）。

表1 单因素实验因素及水平表Table 1 Factors and levels of single factor formula experimental

表2 11种黄酮类化合物出峰顺序和时间Table 2 Peak sequence and time of 11 flavonoids

1.2.7 正交试验设计

通过单因素实验结果确定正交试验设计的因素和水平，选取温度、pH值、碳源添加量以及接种比例四个因素及其对应的三个较优水平，以异鼠李素含量为考察指标设计L9（34）正交试验表，每组试验做3次计算沙棘异鼠李素的平均含量。

1.2.8 沙棘原果汁和沙棘发酵液中基本指标的测定

粗多糖的测定：根据行业标准SNT 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的测定》；总黄酮的测定：根据行业标准NY/T 2010-2011《柑橘类水果及制品中总黄酮含量的测定》；总酚酸的测定：参照Ledoux等人[22]的方法；有机酸的测定：根据国家标准GB 5009.157-2016《食品中有机酸的测定》。

1.2.9 数据分析

实验数据采用SPSS 22.0，进行分析，结果均以平均值±标准差表示，组间比较采用ANOVA单因素分析，P＞0.05为无显著性差异，P≤0.05为差异性显著，P≤0.01为差异性极显著。

2 结果与讨论

2.1 黄酮类化合物高效液相色谱图

图2为黄酮混合标准品色谱图，每种物质都有单一的峰出现，共11个峰，时间与表3出峰顺序和时间相一致，由于异鼠李素在黄酮苷元占比较高，且具有较好的抗氧化和抗肿瘤作用，故后续以异鼠李素的增量作为筛选标准，得出最优的发酵工艺条件。

表3 菌种复配方案Table 3 The recombination scheme of strains

图2 黄酮类化合物高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatography of flavonoids

2.2 菌株筛选结果

2.2.1 单个菌株的筛选结果

以异鼠李素含量为筛选依据，与空白沙棘原果汁相比，除11#菌株发酵后无明显差异之外，沙棘发酵液具有不同层次的差异，但2#、18#、19#、20#、22#、23#、24#、25#菌株发酵后异鼠李素含量显著降低，这可能是因为菌株在此时间段内没有开始发挥作用，一些黄酮类物质作为营养物质被利用掉，沙棘中其它物质的发酵趋势在其它研究中也有表明[23]。故综合筛选得到6株发酵后异鼠李素含量显著性提高的菌株，说明这6株菌具有较好的转化黄酮苷元的能力。它们分别是1#植物乳植物杆菌（L21）、6#德氏乳杆菌（L25）、9#植物乳植物杆菌（L23）、14#戊糖片球菌（P27）、21#德氏乳杆菌（L22）和26#类干酪乳杆菌（L09），如图3所示。

图3 沙棘发酵前后异鼠李素的含量Fig.3 Content of isorhamnetin before and after fermentation of sea-buckthorn

2.2.2 复配菌株的第一次筛选结果

由于1#植物乳植物杆菌（L21）发酵后的异鼠李素含量大于9#植物乳植物杆菌（L23）的含量，6#德氏乳杆菌保加利亚亚种（L25）发酵后的异鼠李素含量大于21#德氏乳杆菌保加利亚亚种（L22）。故选择9#植物乳植物杆菌（L23）、14#戊糖片球菌（P27）、21#德氏乳杆菌保加利亚亚种（L22）和26#类干酪乳杆菌（L09）进行复配，实验设计如表3所示。将不同实验组发酵14 d每隔1 d取一次样品进行检测，选择以异鼠李素增量为筛选依据，与空白相比，如图4所示，12#（L23+P27+L09）菌种组合在第10天的异鼠李素增量相对较高，故选取12#进行后续菌种复配方案优化，这说明菌株复合相比较单个菌株发酵具有更好的效果。

图4 不同实验组的异鼠李素增量Fig.4 Isorhamnetin increment in different experimental groups

图5 不同实验组的异鼠李素增量Fig.5 Isorhamnetin increment in different experimental groups

2.2.3 复配菌株的第二次筛选结果

结合单菌和第一次复配方案，再将发酵菌种的复配方案进行优化。发酵10 d，取样进行检测。如表4设计菌种复配方案，结果显示1#菌种复配组合异鼠李素增量明显，故选择1#菌种组合进行后续工艺优化实验，由此可见更多菌株的复合反而减少菌株之间的协同作用，阻碍次级代谢物质发挥作用，从而减少黄酮苷转化为黄酮苷元。

表4 菌种复配方案优化Table 4 Optimization of the recombination scheme of strains

2.3 单因素试验结果

2.3.1 pH值

在温度为30 ℃、碳源添加量为4%（m/V），接种比例为1:1:1和接种量为1%的条件下，不同pH值条件3、4、5、6和7对发酵液中异鼠李素含量的影响见图6。pH值对异鼠李素增量的影响表现先升高后下降的趋势，并且在pH值为5时，异鼠李素增量表现明显。

图6 pH值对发酵液中异鼠李素含量的影响Fig.6 Effect of pH value on the isorhamnetin content in fermentation broth

2.3.2 温度

在pH值为5、碳源添加量为4%（m/V）、接种比例为1:1:1和接种量为1%的条件下，不同温度条件25、30、35、40和45 ℃对发酵液中异鼠李素含量的影响见图7。结果表明在30 ℃时异鼠李素表现出最高的增量，提升至7.17 mg/L，说明乳酸菌在该温度下表现出较高的活力，利用其次级代谢产物提高黄酮类物质的含量。

图7 温度对发酵液中异鼠李素含量的影响Fig.7 Effect of temperature on isorhamnetin content in fermentation broth

2.3.3 碳源添加量

在温度为30 ℃、pH值为5，接种比例为1:1:1和接种量为1%的条件下，不同碳源添加量2%（m/V）、4%（m/V）、6%（m/V）、8%（m/V）和10%（m/V）对发酵液中异鼠李素含量的影响见图8。由图可知在添加4%（m/V）的碳源时，异鼠李素的增量较高。碳源作为乳酸菌的底物，供给乳酸菌生长。

图8 碳源添加量对发酵液中异鼠李素含量的影响Fig.8 Effect of carbon sources addition on the isorhamnetin content in fermentation broth

2.3.4 接种比例

在温度为30 ℃、pH值为5，碳源添加量4%（m/V）和接种量为1%的条件下，不同接种比例1:1:1、1:2:1、1:1:2、2:1:2和2:1:1对发酵液中异鼠李素含量的影响见图9。接种比例1:1:1时，异鼠李素的增量趋势明显。不同菌株具有不同的转化能力，不同接种比例会影响菌株的生长状态，故影响异鼠李素的含量。

图9 接种比例对发酵液中异鼠李素含量的影响Fig.9 Effect of inoculation proportion on the isorhamnetin content in fermentation broth

2.3.5 正交试验优化发酵工艺

根据单因素实验结果确定正交试验设计的因素和水平，选取温度（A）、pH值（B）、碳源添加量（C）和接种比例（D）为试验因素。正交试验因素水平表如表5所示。结果见表6。

表5 L9（34）正交试验因素水平表Table 5 Design of L9(34) orthogonal test

根据正交试验设计进一步研究，得到正交试验结果。由上表分析结果表明各因素对异鼠李素含量影响大小的顺序依次是pH值＞碳源添加量＞接种比例＞温度，最优条件为A2B1C3D2，即温度30 ℃，pH值为4，碳源添加量为6%（m/V），接种比例为1:2:1。并以最优的条件进行了验证，异鼠李素含量达到15.78 mg/L，与正交试验结果无太大差异，为后续研究提供参考。此结果在付依依等[23]的研究结果中也有同样展示结果，该研究利用酒酒球菌CICC 6066发酵沙棘，得到异鼠李素含量约为1.93 mg/L，与空白对照1.48 mg/L相比，提升约30%，而本研究通过乳酸菌的复配，与空白对照相比，提升约90%。表明多个乳酸菌复合具有较高黄酮苷元转化的能力，而此发酵工艺可以发挥最大的效益。

2.4 基本指标检测结果

黄酮含量的提高对于人体的免疫健康等具有明显的益处；而粗多糖能够降血脂，提高肝脏抗氧化能力，还可以防止一些糖尿病的出现；酚酸可以杀菌，也可作为抗氧化剂，防止自由基氧化反应引起的细胞损伤；有机酸有利于人体及消化，帮助提高食欲，增强免疫力软化血管等功效。如表7所示，沙棘发酵液与沙棘原果汁相比，基本指标所测含量都有所提升，总黄酮含量无明显差异，但含量提升约108%，有效的提高了发酵液中总黄酮含量。崔欣悦等[24]利用单个乳酸菌发酵橘皮黄酮，其得率提高至0.21 mg/g，提升了20%，由此可见本研究多个乳酸菌复合发酵具有更好转化黄酮苷元的作用。发酵前后两者的粗多糖、总酚酸以及有机酸含量都具有显著性差异。付依依等[25]检测总酚酸的结果发酵后的含量约为586.00 mg/L，提升约4%，本研究提高了约5倍。由此可见乳酸菌复合发酵沙棘原果汁可以明显提升基本指标含量，帮助其提高作用功效，在促进人体健康方面具有很大的潜力。

表7 基本指标的检测结果Table 7 Test results of basic indicators

3 结论

本研究通过对26个菌株进行单菌株发酵沙棘原果汁筛选，选出6个具有较好转化的菌株进行复配发酵，最终得到植物乳植物杆菌L23、戊糖片球菌P27和植物乳植物杆菌L21这三个菌株复配效果最好；再通过单因素试验和正交试验进行优化，得到沙棘的发酵工艺条件为：植物乳植物杆菌L23、戊糖片球菌P27和植物乳植物杆菌L21在pH值为4，温度30 ℃，添加碳源6%，接菌比例为1:2:1时发酵得到的黄酮苷元含量较高，在此条件下，异鼠李素的含量提升至15.78 mg/L，与空白对照8.26 mg/L相比提升了约90%。可见植物乳植物杆菌L23、戊糖片球菌P27和植物乳植物杆菌L21在优化发酵工艺后具有更好转化沙棘黄酮苷元的能力，这些数据为后续的相关研究提供参考，同时本研究还提供一种检测11种黄酮类物质高效液相色谱的检测方法。

利用发酵手段及对发酵条件的有效控制实现对黄酮类物质的转化及相关机理的探究，提高了生物转换效率，为实现黄酮类化合物等功能资源的高值化利用提供数据支撑，同时为今后利用沙棘发酵工艺实现产业化生产奠定了基础，为黄酮苷和黄酮苷元具体转化机制提供数据参考。