网络药理学和分子对接探究鼻灵散治疗CRS的作用机制*

雷 琳 蒋巧萍 雷志钧 汤六凯 王志琪 王丹艳

鼻炎分为慢性鼻炎、急性鼻炎、药物性鼻炎、 萎缩性鼻炎[1],其中慢性鼻炎最为常见,按病理分类,慢性鼻炎有变应性鼻炎(AR)和非变应性鼻炎(NAR)2种[2]。AR又称过敏性鼻炎,目前尚无疗效确切、不良作用少的药物和疗法[3]。反复迁延发作的AR和NAR都会形成慢性鼻炎,这是一种鼻部常见的慢性炎症性疾病。流行病学资料显示,慢性鼻炎和AR呈相同的趋势增长,两者存在某些内在联系以及类似炎症机制[4]。

鼻灵散是赵俊欣[5]继承师父张大昌的传验方,进一步结合自己的临床经验组方而成,该方使用多年,治愈者不胜枚举,取得了可重复性的治疗效果。鼻灵散由辛夷、柴胡、桔梗、葶苈子组成,组方平和,临床治疗顽固性鼻窦炎效果颇佳,适用于慢性鼻窦炎,头痛(包括额、眼等部位疼痛),鼻流脓性涕、黏液性涕,鼻塞等症。

中医药成分复杂、配伍灵活的特点使其治疗慢性疾病有一定的优势,但也存在着起效较缓、治疗机制不明确等问题。本研究采用网络药理学的方法,从药物的物质基础出发,从整体角度分析鼻灵散治疗鼻炎的分子机制,通过大数据分析和“多成分-多靶点-全方位”的研究,为中药作用机制研究提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 药物活性成分及作用靶点的筛选借助中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索鼻灵散中的中药化学成分及其相应的药效学参数[6]。在Uniprot蛋白质数据库中将化合物的作用靶点进行规范。结合检索结果建立鼻灵散的化学成分数据库。

1.2 疾病相关靶点获取以“rhinitis”“allergic rhinitis”“nasosinusitis”等为关键词,在GeneCards[7]、OMIM数据库[8]中进行检索,并在DRUGBANK数据库[9]中寻找治疗鼻炎的临床一线西药作用靶点予以补充。

1.3 药物-活性成分-靶点网络的构建通过Venny 2.1.0将鼻灵散的靶点与鼻炎的靶点取交集,所得交集靶点集为鼻灵散的活性成分作用于鼻炎的潜在核心靶点。通过CytoScape 3.7.1构建鼻灵散“药物-活性成分-靶点”网络图,利用CytoScape 3.7.1内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数,并根据网络拓扑学参数对核心靶点及发挥药效的主要活性成分进行分析。

1.4 鼻灵散成分-鼻炎靶点的PPI网络构建将潜在核心靶点集提交至STRING 11.0数据库[10],设置生物种类为“Homosapiens”,构建蛋白互作(PPI)网络模型,并将结果导入CytoScape 3.7.1中,使用内置工具对靶点的网络拓扑参数进行分析。

1.5 靶点功能与通路的富集分析Metascape平台 拥有全面的注释功能并且每月更新基因注释的数据资料。将鼻灵散治疗鼻炎的潜在核心靶点集录入Metascape平台,设置P<0.01,进行基因本体分析和途径分析,包括生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)。

1.6 分子对接为了初步考察网络药理学的分析结果的准确性,对1.3项下鼻灵散“中药-活性成分-鼻炎靶点”网络图中网络结点度值(Degree)≥10的活性成分和靶点蛋白进行分子对接。先获取化合物与靶点蛋白的3D结构;再使用AutoDock Tools软件将小分子和蛋白质的3D结构转换为“PDBQT”格式;最后使用AutoDock vina软件进行分子对接。打分系统使用结合自由能(Predicted binding affinity),Affinity的绝对值越大,表示预测的配体与蛋白质分子之间的结合性越好。

2 结果

2.1 鼻灵散活性成分靶点的获取在TCMSP数据库中,以OB>30%,DL≥0.18为筛选条件,初步筛选得到柴胡活性成分13种,桔梗活性成分4种,葶苈子10种,辛夷15种;从相关文献中补充鼻灵散化合物26种,其中柴胡含7种化合物,葶苈子含14种化合物,辛夷含5种化合物。同时通过知网等论文大数据整理,有些化合物虽然DL<0.18,但含量较高,仍纳入。综合上述结果并删除重复项,一共收集了58种鼻灵散化合物。

用TCMSP数据库提供的化合物靶点预测的功能接口对化合物进行靶点预测。辛夷对应靶点48个,柴胡对应靶点206个,桔梗对应靶点70个,葶苈子对应靶点190个,合并后删除重复值共得到靶点250个。

2.2 鼻炎相关靶点获取根据Genecards、OMIM、DRUGBANK数据库挖掘鼻炎相关基因,去掉重复值后有1323个,将鼻炎基因与药物靶点基因取交集,最终获得58个鼻灵散与鼻炎的靶基因。

2.3 主要成分-作用靶点网路构建运用CytoScape 3.7.1构建鼻灵散“药物-成分-靶点”网络图,共有437条边,116个节点。柴胡和葶苈子的共有活性成分:异鼠李素、山奈酚、槲皮素。通过CytoScape 3.7.1中的Network Analyzer分析鼻灵散治疗鼻炎网络拓扑学参数,得到核心成分及核心作用靶点。见表1。

表1 鼻灵散主要活性成分网络节点特征参数

2.4 蛋白质相互作用(PPI)网络的构建与分析将鼻灵散与鼻炎的58个交集基因提交至STRING 11.0平台,得到鼻灵散靶点PPI网络及相关数据。为了更直观地分析蛋白质相互作用程度,将所得数据导入CytoScape 3.7.1,通过Network Analyzer分析,可知蛋白质相互作用(PPI)网络中节点平均连接度数为20.38,以Degree>30为核心靶点的筛选条件,共筛选出15个靶点,这些靶点与其他蛋白的相互作用更强,在该网络中发挥了关键作用。

2.5 核心靶点富集分析与可视化采用Metascape数据库对鼻灵散治疗鼻炎的主要靶点进行GO和KEGG分析,通过Venny 2.1.0对结果进行可视化。

GO-BP分析结果表明,鼻灵散主要参与的生物学过程包括细胞因子介导的信号通路(Cytokine-mediated signaling pathway)、细胞对脂多糖的应答(Response to lipopolysaccharide)、细胞对细菌起源分子的应答(Response to molecule of bacterial origin)以及细胞对氮化合物的应答(Cellular response to nitrogen compound)。

GO-MF分析结果显示,相关靶点治疗鼻炎的功能富集于与细胞因子受体结合(Cytokine receptor binding)、细胞因子活动(Cytokine activity)、受体调节活动(Receptor regulator activity)、受体配体活动(Receptor ligand activity)、G蛋白偶联的乙酰胆碱受体活动(G protein-coupled acetylcholine receptor activity)。

KEGG分析显示,其参与的通路主要有细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌症通路(Pathways in cancer)、动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、疟疾(Malaria)、美洲锥虫病(Chagas disease American trypanosomiasis)等。

2.6 分子对接模拟选择2.3项中“中药-活性成分-鼻炎靶点”Degree值>9的7个核心成分和Degree值>10的10个潜在蛋白靶点进行分子对接,并对蛋白靶点的原配体进行分析。保留结合自由能(Predicted binding affinity,kcal mol-1)最高绝对值的分子对接结果,并与原配体的对接结果进行比较,结合自由能的绝对值越高则代表配体与蛋白质结合能力越强。数据经热图分析,使用Paymol软件对蛋白质和活性化合物相互作用进行分析,发现核心成分与靶点之间具有良好的结合活性。

3 讨论

3.1 成分分析通过数据挖掘初步筛选出鼻灵散治疗鼻炎的活性成分有槲皮素、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、百里香酚、滨蒿内酯等。有研究表明,槲皮素可以减轻大鼠变应性鼻炎症状,山奈酚对肥大细胞所介导的过敏性鼻炎有一定的抑制效应,木犀草素可以通过多种途径缓解炎症反应。分子对接验证也表明,槲皮素、山奈酚、木犀草素与主要靶点(PTGS2、PTGS1、NOS2、RELA)的结合能力较强,因此推测鼻灵散BLS主要是通过槲皮素、山奈酚、木犀草素等活性成分来改善鼻炎症状。辛夷中木兰脂素具有较强的抗过敏作用,对炎症早期有明显的抑制作用,可视为辛夷抗炎、抗过敏作用的活性成分。

目前数据挖掘得到的大部分中药方剂主要成分皆为槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等,这些成分具有抗病毒、抗炎、抗过敏等基本药理作用,临床配伍使用不同的引经药,即可将药物的联合功效引至机体相应的部位、器官或系统,起到“异病同治、同病异治”,治本的临床效果,从而解释中药“多成分-多靶点-全方位”的作用原理。鼻灵散中辛夷作为引经药,能将上述药物成分引入鼻部,起到治疗作用。

3.2 作用靶点分析通过 PPI网络分析与“药物-成分-靶点”网络相映射发现鼻灵散中活性成分可能通过调控 PTGS2、PTGS1、IL-6、IL1B、NOS2、GABRA2 等核心靶点干预鼻炎。PPI 网络分析与“药物-成分-靶点”网络相映射的结果显示,PTGS2 的连接度均排在前列,PTGS2 又称环氧合酶 2(COX-2),是前列腺素E2(PGE2)生产中的关键步骤,其表达与机体免疫活性密切相关,COX-2的过度表达会导致血管壁的炎性反应。鼻灵散中存在 COX-2 抑制剂,推测通过降低 COX-2 表达发挥抗炎的效果。 PPI 网络分析结果显示IL-6 的连接度最高,IL-6 是一种具有广泛生物学活性多功能的细胞因子,也是各种炎症感染的关键细胞因子, 它促使疾病进展并维持免疫反应,在适应性免疫和慢性炎症等病理过程中起重要作用。

3.3 信号通路预测在对 BLS 作用靶点参与的生物学过程进行 KEGG 富集分析时发现,鼻灵散治疗鼻炎的通路主要有 IL-17 信号通路、TNF 信号通路。IL-17 是 TH17 细胞分泌的特征性细胞因子,在抵抗病原体入侵以及诱导和维持慢性炎症的过程中发挥了重要的作用。TNF-α是一种促炎因子,具有重要的调控免疫,控制感染作用。分子对接结果显示,鼻灵散治疗鼻炎的主要活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇与作用靶点PTGS2、NOS2、 GABRA2、PTGS1的结合活性均较强,与本研究结果吻合。

综上所述,本研究通过数据挖掘,找到部分预测的活性成分和靶点关系:证明了鼻灵散的成分与AR或CRS的共同靶点之间存在良好的化学连接,鼻灵散可能通过调节细胞炎症因子表达、介导物质代谢、影响细胞存活/凋亡途径等途径来治疗,且与细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)等信号通路密切相关。鼻灵散在临床上治疗顽固性的鼻炎-鼻窦炎有很好的疗效,本项目组首次对该方进行研究,通过数据挖掘为中医临床治疗慢性鼻炎的经验方提供了现代分子依据。