黄芩苷调节Notch/JAG1信号通路对舌癌细胞恶性生物学行为的影响

王 欢, 夏 力, 李 玮, 谢春凤

(四川省绵阳市中心医院耳鼻咽喉颌面外科, 四川 绵阳 621000)

舌癌是一种恶性程度高、已发生早期迁移和侵袭的口腔癌之一,98%以上为鳞状细胞癌。虽然手术治疗提高了患者的存活率,但仍然很低。此外,手术对患者身体的伤害也很大。因此,有时有必要进行放疗和化疗,以防止癌症复发。促进舌癌细胞上皮-间充质转化(EMT),是舌癌预后不良的独立危险因素[1]。因此,研究一些低损伤效应的药物和基因治疗可以加强癌症的预防和治疗。黄芩苷(Bai)是一种苄基异喹啉生物碱,是中草药黄芩的主要活性成分,已被证明在人类癌症中具有抗增殖、抗炎和抗转移作用[2]。相关研究发现,Bai抑制乳腺上皮细胞EMT过程,抑制乳腺癌的发生[3]。但是关于Bai在舌癌上的研究还尚未见人报道。Notch通路是研究舌癌的常见通路,下调Notch/JAG1信号轴可以抑制舌癌细胞EMT、迁移、侵袭,从而起到抗舌癌效果[4]。近期,人们发现Bai可以通过调节Notch通路抑制足细胞损伤[5]。本研究的创新点是首次研究了Bai对舌癌上的作用效果及其作用机制。本研究旨在探究Bai是否可以通过抑制Notch/JAG1信号通路对舌癌细胞恶性生物学行为产生影响。

1 材料与方法

1.1细胞及主要材料:人舌磷癌细胞CAL27购自南京万木春生物科技有限公司;人口腔上皮细胞HOEC购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司;Bai(HPLC≥98%)购自上海玉博生物科技有限公司;Notch/JAG1通路激活剂VPA购自北京百奥莱博科技有限公司;MTT细胞增殖及毒性检测试剂盒购自江西艾博因生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;E-cadherin兔抗一抗、vimentin兔抗一抗、Snail兔抗一抗、Notch1兔抗一抗、JAG1兔抗一抗、内参蛋白GAPDH兔抗一抗、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗均购自Abcam;酶标仪(型号:EnVision)购自珀金埃尔默企业管理有限公司;离心机(型号:Multifuge X4F)购自ThermoFisher公司;NovoCyte 流式细胞仪购自广州柏赛柯生物技术有限公司;Transwell小室购自北京达科为生物技术有限公司。

1.2细胞培养:将购买的CAL27和HOEC细胞均在DMEM培养基中培养,并补充有10%胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素,培养基置于5%CO2,37℃培养箱培养。

1.3MTT法检测Bai对HOEC细胞毒性的影响:收集HOEC细胞悬液稀释至5×104个/mL,取20μL细胞悬液接种在96孔板上,培养1d后,细胞进入对数生长期时添加不同浓度的Bai(0、10、20、30、40、50和100μM)继续培养24h,然后在每孔中加入浓度为5mg/mL的MTT溶液25μL,室温孵育4h后,加入100μL二甲基亚砜,充分震荡后测量570nm处吸光度值。

1.4细胞分组:将CAL27细胞分为CAL27组(未处理的CAL27细胞)、L-Bai组(10μM Bai处理CAL27细胞)、M-Bai组(20μM Bai处理CAL27细胞)、H-Bai组(40μM Bai处理CAL27细胞)[6]、VPA组(8mM Notch/JAG1通路激活剂VPA处理CAL27细胞[7])、H-Bai+VPA组(40μM Bai和8mM VPA共同处理CAL27细胞),培养48h。收集细胞,按照1.3的操作步骤检测Bai对CAL27细胞活力的影响。

1.5流式细胞术检测CAL27细胞凋亡:收集用药物处理的CAL27细胞,用冷却的PBS洗涤两次后,重新悬浮在结合缓冲液中,然后在室温避光条件下用5μL的Annexin V-FITC孵育5min,加入5μL PI孵育15min,最后,用流式细胞仪分析各组CAL27细胞凋亡率。

1.6Transwell检测CAL27细胞侵袭、迁移能力:将药物处理过的各组CAL27细胞用无血清培养基重悬,用有基质胶(侵袭)或不涂有基质胶(迁移)的Transwell评估CAL27细胞侵袭、迁移能力,首先,用移液枪吸取100μL浓度为4×105个细胞/mL的细胞悬液到Transwell上室,同时用移液枪吸取500μL DMEM培养基到Transwell下室,37℃下孵育24h后用棉签去除膜上表面细胞,然后用4%多聚甲醛固定细胞20min,之后,将这些细胞用0.1%结晶紫染色10min。通过倒置显微镜以200倍放大倍率对侵袭、迁移细胞进行成像,并手动计数细胞数量。

1.7Western blot检测EMT蛋白以及Notch/JAG1信号通路蛋白表达:使用RIPA缓冲液从细胞中提取总蛋白,然后在4℃下以12000rpm的转速离心10min。收集上清液,并使用BCA蛋白质定量试剂盒定量蛋白质浓度。10% SDS-PAGE凝胶电泳分离等量蛋白质,然后通过电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%牛血清白蛋白封闭后,将膜与一抗在4℃孵育过夜,一抗为:E-cadherin(1∶2000)、vimentin、(1∶2000)、Snail(1∶1000)、Notch1(1∶1000)、JAG1(1∶2000)和GAPDH抗体(1∶2000),然后,用TBST洗涤后与HRP偶联的二抗孵育,并使用ECL显色试剂盒使目的条带可视化后,用ImageJ分析灰度值。

2 结 果

2.1Bai对HOEC细胞毒性作用:0～100μM Bai对HOEC细胞无明显毒性影响(P>0.05),见表1。

表1 Bai对HOEC细胞的毒性作用

2.2Bai对CAL27细胞活力的影响:与CAL27组相比,L-Bai组、M-Bai组、H-Bai组OD值依次显著减小(P<0.05),Bai呈现剂量相关性,而VPA组OD值显著增大(P<0.05);与H-Bai组相比,H-Bai+VPA组OD值显著增大(P<0.05),见表2。

表2 各组CAL27细胞活力比较

2.3Bai对CAL27细胞凋亡的影响:与CAL27组相比,L-Bai组、M-Bai组、H-Bai组凋亡率依次显著上升(P<0.05),Bai的处理效果呈现剂量依赖性,而VPA组凋亡率显著下降(P<0.05);与H-Bai组相比,H-Bai+VPA组凋亡率显著降低(P<0.05),见图1,表3。

图1 流式细胞术检测CAL27细胞凋亡率

表3 Bai对CAL27细胞凋亡率的影响

2.4Bai对CAL27细胞迁移、侵袭的影响:与CAL27组相比,L-Bai组、M-Bai组、H-Bai组CAL27细胞迁移、侵袭数量依次显著减少(P<0.05),且随着Bai添加剂量的增加,细胞迁移、侵袭数量下降的更显著,而VPA组CAL27细胞迁移、侵袭数量显著升高(P<0.05);与H-Bai组相比,H-Bai+VPA组CAL27细胞迁移、侵袭数量显著上升(P<0.05),见图2、表4。

表4 Bai对CAL27细胞迁移和侵袭的影响

2.5Bai对CAL27细胞EMT的影响:与CAL27组相比,L-Bai组、M-Bai组、H-Bai组CAL27细胞E-cadherin蛋白水平依次显著升高(P<0.05),vimentin、Snail蛋白水平依次显著降低(P<0.05),而VPA组CAL27细胞E-cadherin蛋白水平显著减少(P<0.05),vimentin、Snail蛋白水平显著增加(P<0.05);与H-Bai组相比,H-Bai+VPA组CAL27细胞E-cadherin蛋白水平显著下降(P<0.05),vimentin、Snail蛋白水平显著上升(P<0.05),见图3、表5。

图3 Western blot检测CAL27细胞EMT相关蛋白表达

表5 Bai对CAL27细胞EMT相关蛋白的影响

2.6Bai对CAL27细胞Notch/JAG1信号通路蛋白的影响:与CAL27组相比,L-Bai组、M-Bai组、H-Bai组Notch1、JAG1蛋白水平依次显著下调(P<0.05),而VPA组Notch1、JAG1蛋白水平显著上调(P<0.05);与H-Bai组相比,H-Bai+VPA组Notch1、JAG1蛋白水平显著升高(P<0.05),见图4、表6。

图4 Western blot检测CAL27细胞中Notch1、JAG1蛋白水平

表6 Bai对CAL27细胞中Notch1 JAG1蛋白水平的影响

3 讨 论

Bai具有多种药理作用,包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。Bai可以抑制结肠癌细胞EMT、迁移、侵袭,是临床上治疗结直肠癌的重要候选药物[8]。本研究用Bai处理HOEC细胞,结果发现,0～100μM Bai对HOEC细胞无明显毒性影响。表明Bai对正常细胞无明显毒性作用。而Bai处理CAL27细胞后,CAL27细胞OD值显著下降,凋亡率显著升高,且Bai对舌癌细胞的作用效果呈现剂量依赖性,表明Bai可抑制舌癌细胞增殖,促进其凋亡,从而抑制舌癌发展。

EMT被认为是癌细胞发展的重要过程,在癌症转移和侵袭过程中被激活。在EMT中,上皮细胞失去其上皮特征(如E-cadherin的下调),获得间质表型(如N-cadherin和vimentin的上调),并激活下游转录因子(如Snail、Slug、Twist)[9]。EMT使得癌细胞获得迁移和侵入周围基质的能力,随后通过血液和淋巴管扩散到远处[10]。因此,抑制癌细胞EMT过程是治疗癌症的常见措施。本研究发现,Bai处理后CAL27细胞迁移、侵袭数量、vimentin、Snail蛋白水平显著下降,E-cadherin蛋白水平显著升高,表明Bai可能通过升高CAL27细胞E-cadherin水平使上皮细胞保持上皮特征,阻止其获得间质表型,进而抑制CAL27细胞扩散到其它临近组织。

Notch信号通路是一种进化上高度保守的细胞间通信途径,可调节细胞间通讯并参与器官发育和细胞内平衡,当Notch受体和配体JAG1相互作用时,该途径被激活[11]。Zhang等[12]发现,下调Notch信号通路可以通过抑制EMT来抑制舌癌细胞迁移和侵袭。Liu等[13]也发现,下调Notch通路,可以使N-cadherin、Vimentin和Snail表达降低,E-cadherin表达增加,抑制舌癌细胞EMT进程,进而起到抗舌癌作用。本研究发现,Bai处理CAL27细胞后,CAL27细胞Notch1、JAG1蛋白水平显著下降,表明Bai可能通过下调Notch/JAG1信号轴来发挥抑制舌癌发展的作用。为了进一步证实猜测,我们用Notch/JAG1信号通路激活剂VPA处理CAL27细胞以及40μM Bai处理的CAL27细胞,结果发现VPA的作用效果与Bai的作用效果相反,且VPA逆转了Bai对CAL27细胞的抑癌效果。

综上所述,Bai可能通过抑制Notch/JAG1信号传导抑制CAL27细胞EMT过程,进而抑制细胞迁移和侵袭,从而起到抗舌癌的效果。且在本研究中,Bai对CAL27细胞的影响效果呈现剂量相关性。本文的不足是缺少临床研究,我们将在接下来的研究中深入探索。