基于网络药理学和分子对接技术探讨解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的作用机制▲

林泽宏 周红海 魏纪湖 罗 灏 柒万强 唐 俊

(广西中医药大学1 研究生院,2 骨伤学院,广西南宁市 530001)

肩袖损伤是常见的肩关节疾病,以肩部疼痛、活动障碍为主要症状,其在全部肩关节疾病中的占比为5%～40%,且在临床上30%～70%的肩关节疼痛与肩袖损伤有关[1]。肩袖损伤的患病风险与年龄呈正相关,60～69 岁人群的患病率可达 31%,而 80 岁以上人群的患病率预计可达 65%[2]。近年来,随着我国社会人口老龄化加剧,我国的肩袖损伤患病率也在逐年增加,这加大了社会和个人的经济压力。目前除手术治疗外,中医药疗法在肩袖损伤的保守治疗中占有重要地位[3]。如何缓解肩袖损伤患者的疼痛,改善关节活动度,减少肩袖软组织变性,防止肌腱进一步撕裂,是肩袖损伤保守治疗的临床和科研热点。因此,探索一种安全、有效的中药方剂对于肩袖损伤的保守治疗具有重要意义。

中医中并无“肩袖损伤”的直接记载,但根据综合临床表现和病因病机,应将其归属于中医“痹症”中的“肩痹”范畴。解痉散瘀汤是我国国医大师韦贵康教授运用“活血通经,解痉散瘀”之法治疗颈肩痹痛的良方,临床研究表明,该方对肩痹有明确的疗效[4],但目前其治疗肩袖损伤的作用机制还不明确。而中药复方的作用机制具有多成分、多靶点的特点,故本研究通过网络药理学及分子对接技术,探讨解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的潜在机制,以期为肩袖损伤保守治疗的临床用药及研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 活性成分及其作用靶点的筛选 (1)通过中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/index.php)获取白芍、赤芍、当归、丹参、甘草、两面针、牛膝、桃仁、豨莶草的所有活性成分,然后设置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且类药性(drug-likeness,DL)≥0.18初步筛选主要活性成分,再通过TCMSP进一步检索主要活性成分的作用靶点。(2)通过中国知网(https://www.cnki.net/)检索有关地龙活性成分研究的文献[5-7],收集地龙的活性成分,通过ChemDraw软件绘制活性成分的分子结构并保存为.sdf格式。将.sdf格式文件上传SwissADME平台(http://www.swissadme.ch/)筛选主要活性成分,筛选条件为“Pharmacokinetics”项的“GI absorption”结果为“High”,且“Druglikeness项”的5种预测(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)结果中有2个及2个以上为“Yes”。将地龙主要活性成分的.sdf格式文件上传至SwissTargetPrediction平台(http://swisstargetprediction.ch/),设置物种为“Homo Sapiens”且probability>0,对主要活性成分的作用靶点进行预测。(3)使用R语言将获得的所有靶点进行合并去重,然后通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)将靶点名转换为规范的基因名称[8]。

1.2 解痉散瘀汤治疗肩袖损伤潜在作用靶点的筛选 使用“Rotator Cuff Tears”作为检索词,在GeneCards®数据库[9](www.genecards.org)和OMIM®数据库(https://www.omim.org)中检索肩袖损伤的相关靶点,将两个数据库的结果进行合并去重。通过VENNY 2.1平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将解痉散瘀汤主要活性成分的作用靶点与肩袖损伤的相关靶点进行映射取交集,得到解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的潜在作用靶点。

1.3 构建成分-靶点网络 使用Cytoscape 3.9.1软件,对主要活性成分及解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的潜在作用靶点进行分析并构建成分-靶点网络。通过Cytoscape 3.9.1软件的Network Analyzer插件分析成分-靶点网络的拓扑参数,根据节点连接度由大到小进行排序,将连接度位居前5的主要活性成分作为解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的关键活性成分。

1.4 构建蛋白-蛋白相互作用网络 将解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的潜在作用靶点导入STRING 11.5 平台(https://string-db.org),设定物种为“Homo sapiens”,可信度为0.4,剩余参数均为默认值,最终获得解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,将数据导入Cytoscape 3.9.1软件的cytoNCA插件,分析中介中心性、接近中心性、度中心性、特征向量中心性、局部平均连接中心性及网络中心性共6个参数进行2次筛选,最终以度中心性值大于中位值的靶点作为核心靶点。

1.5 功能富集分析和通路富集分析 将解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的潜在作用靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),设置物种为“Homo Sapiens”,进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05作为筛选标准[10]。将分析结果导入微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化处理。

1.6 关键活性成分与核心靶点蛋白的分子对接 首先,通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取关键活性成分的2D结构,采用ChemOffice软件对其进行优化并制作其3D结构。然后,通过RCSB PDB数据库(https://www.pdbus.org/)获取核心靶点蛋白的3D结构,并通过PyMol软件对其进行去水、去小分子配体等优化。最后,通过AutoDock 1.5.6软件实现关键活性成分与核心靶点蛋白的分子对接,以结合能大小判定分子对接是否成功,结合能≤0 kcal/mol表明配体与受体可以自发结合,一般来说分子间的结合能越低,则发生作用的概率越大,结合越稳定。

2 结 果

2.1 解痉散瘀汤的主要活性成分及其作用靶点 通过TCMSP共获得主要活性成分273个及其作用靶点270个,其中白芍、赤芍、当归、丹参、甘草、两面针、牛膝、桃仁、豨莶草的主要活性成分分别有13个、29个、2个、65个、92个、20个、20个、23个、9个。通过SwissADME平台获得地龙的主要活性成分47个及其作用靶点679个。合并去重后,共获得解痉散瘀汤的主要活性成分291种、作用靶点835个。

2.2 解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的潜在作用靶点 经合并去重后,从GeneCards®数据库和OMIM®数据库共获得肩袖损伤相关靶点357个。通过VENNY 2.1平台将肩袖损伤的相关靶点与解痉散瘀汤主要活性成分的作用靶点取交集,共获得解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的潜在作用靶点95个。

2.3 成分-靶点网络及关键活性成分筛选结果 将主要活性成分与解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的潜在作用靶点导入Cytoscape 3.9.1软件,构建得到的成分-靶点网络包含节点237个、连线729条,见图1。在网络中,连接度位居前5的主要活性成分依次为槲皮素、环(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)二肽、木犀草素、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸、山柰酚,即关键活性成分。关键活性成分的基本信息见表1。

表1 关键活性成分的基本信息

图1 成分-靶点网络

2.4 PPI网络及核心靶点筛选结果 通过STRING 11.5平台对解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的95个潜在作用靶点进行分析,剔除独立靶点,得到PPI网络数据,然后将数据导入Cytoscape 3.9.1软件进行拓扑分析和可视化,见图2。拓扑分析结果显示,白细胞介素(interleukin,IL)-1B、丝氨酸/苏氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1,AKT1)、血管内皮生长因子 A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)1为网络中的核心靶点。

图2 PPI网络图

2.5 GO功能富集分析结果 对解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的95个潜在作用靶点进行GO功能富集分析,共获得736个条目,包括566个生物过程,60个细胞组分,110个分子功能。以-lgP值进行由大到小排序选出前10个条目进行可视化,见图3。

图3 GO富集分析结果的可视化图

2.6 KEGG通路富集分析结果 对解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的95个潜在作用靶点进行KEGG通路富集分析,共获得142条通路,潜在作用靶点主要涉及晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路等信号通路。以-lgP值进行由大到小排序。将前15条通路制作成气泡图,见图4。

图4 KEGG通路富集分析的可视化图

2.7 分子对接分析结果 所有关键活性成分和核心靶点蛋白对接的结合能均≤0 kcal/mol,表明解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的关键活性成分和核心靶点均具有较好的结合活性,见表2。选取部分分子对接结果进行展示,见图5。

图5 部分分子对接结果的可视化图

3 讨 论

肩袖损伤在中医学中属于“痹症”中的“肩痹”范畴,临床上常以“肩痹”治法治之。解痉散瘀汤为国医大师韦贵康教授为肩部病痛所创良方,有活血通经、解痉散瘀的功效,可使经脉通、气血顺,损伤之筋脉得以濡养,脉通筋柔,痹痛得消,临床疗效颇佳[4]。方中以丹参为君药,丹参可调和气血,行而不破,散中有收;当归、桃仁、赤芍通行三焦,行血散瘀;白芍、甘草、牛膝、地龙缓急解痉止痛,再配以两面针、豨莶草消肿止痛,共奏活血散瘀、解痉止痛之功。

本研究通过构建成分-靶点网络,获得5个关键活性成分,包括槲皮素、木犀草素、环(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)二肽、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸、山柰酚。肩袖组织发生急性损伤或是受到长期反复的机械性损伤时,损伤组织局部存在不同程度的炎症反应,而持续、过度的炎症反应会加重患者的疼痛感,以及影响肩袖组织的修复[11]。槲皮素通过提高超氧化物歧化酶和MMP抑制剂的水平,以及降低肿瘤坏死因子α、IL-1B、MMP的水平,来抑制炎症反应及氧化应激反应,延缓蛋白聚糖的降解,从而促进肩袖损伤后软组织的修复[12-13]。木犀草素通过核转录因子κB通路,减少IL-1B、肿瘤坏死因子α等炎症因子的分泌,减轻损伤组织的局部炎症反应[14]。山柰酚能通过核转录因子κB信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,降低诱导型一氧化氮合成酶、肿瘤坏死因子α等促炎性细胞因子的表达水平,发挥抗炎、镇痛的作用[15-16]。环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)二肽、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸是存在于地龙的生物类小分子多肽,具有良好的消炎、镇痛效果[17]。上述关键活性成分的药理作用表明解痉散瘀汤可提升人体抗氧化能力,减轻炎症反应,从而缓解肩袖损伤患者的疼痛。

本研究PPI网络拓扑分析结果显示,IL-1B、AKT1、VEGFA、MMP9、FN1为解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的核心靶点。肩袖组织损伤后,局部释放大量细胞因子,激活多种生物信号通路,形成复杂的靶点-通路调控网络,在肩袖损伤的炎症期、愈合期和重塑期发挥重要作用[18]。在软组织损伤早期,毛细血管破裂和细胞内液渗透导致局部组织充血肿胀,肿瘤坏死因子、IL-1B等致炎因子被大量释放,从而激活p38MAPK等炎症相关信号通路,进而诱发炎症级联反应[19]。大量研究表明,IL-1B、AKT1是肩袖损伤炎症期重要的促炎性细胞因子,通过核转录因子κB、MAPK等多条信号通路在损伤组织局部参与炎症反应的发生[20-22]。VEGFA可促进血管形成,改变血管通透性,参与炎症反应、细胞凋亡,在肩袖损伤的病理过程中有重要作用[23]。损伤的肩袖组织会在分子层面进行重塑,表现为腱细胞减少、细胞凋亡增加和胶原蛋白排列紊乱,增加后期肩袖再撕裂的概率,影响肩关节功能[24]。MMP家族通过重塑损伤细胞外基质改变组织形态,有研究表明,在肩袖损伤组织中MMP9表达显著升高,其过度活跃会影响肩袖组织的修复,而抑制其表达可促进肩袖损伤后的腱骨愈合[25-26]。FN1广泛存在于细胞外基质,是组织修复的重要材料,通过与细胞外基质受体相互作用来促进整合蛋白释放,从而促进组织修复[27]。

本研究KEGG通路富集分析结果显示,解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的潜在作用靶点主要涉及的信号通路有晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路。晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路可通过调控氧化修饰性蛋白质的生成,促进炎症发生与发展,同时炎症因子激活免疫细胞,导致损伤组织局部炎症反应进一步加剧[28]。缺氧诱导因子1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路及IL-17信号通路的表达,促进炎症因子、促血管形成因子及基质金属蛋白酶释放,影响炎症反应、细胞凋亡与组织重塑[29-31]。GO功能富集分析结果显示,潜在作用靶点基因主要涉及的生物学过程有脂多糖反应、低氧反应、过氧化氢反应、胶原分解代谢过程、蛋白水解等,这些生物学过程均与炎症反应和组织重塑有关[32-33]。综上,解痉散瘀汤主要通过影响与炎症反应、细胞凋亡及血管生成相关的信号通路,来抑制炎症反应、调控损伤组织局部细胞凋亡、抑制组织过度重塑,进而减缓肩袖损伤的发展,改善患者预后。

本研究通过网络药理学筛选出解痉散瘀汤的主要活性成分,初步探明其以多成分、多靶点、多通路的方式,通过抑制炎症反应、调控损伤组织重塑等机制,来发挥治疗肩袖损伤的作用,这或许可为今后解痉散瘀汤治疗肩袖损伤的相关实验提供理论依据。