肾气丸对肾间质纤维化大鼠肾组织TGF-β1/Smad3信号通路及AngⅡ表达的影响

张忠阳 凌家艳 周盾

(武汉市第一医院中医综合科,湖北 武汉 430022)

肾间质纤维化是多种肾脏受累疾病发展至肾脏衰竭的关键事件,该病主要以肾组织微血管纤维化、肾小管间质纤维化及肾小球硬化为主要病理改变。如果不能及时有效的控制肾组织的纤维化进程,极易诱发脏器衰竭等恶性事件的发生。该病的分子机制尚未完全阐明,西医药技术只能缓解患者的临床症状,不能准确而及时的修复肾脏损伤〔1〕。因此深入揭示疾病进展中的分子机制,积极寻找可靠的治疗靶点,是临床医师急需解决的关键问题。肾间质纤维化在中医上归为“肾脉瘀阻”范畴,在我国传统中医药发展的进程中,积累了一系列的中医药方法通过活血化瘀、温补肾阳等手段改善患者的肾脏组织微循环,阻滞肾脏纤维化进程,改善患者的肾功能〔2〕。肾气丸出自《金匮要略》,主要由肉桂、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻及山茱萸、附子、熟地黄等八味中药组成。现代药理学的研究显示〔3〕,肾气丸具有调节内分泌,抑制炎性进展、增强免疫功能和保肾护肝等效用。赵峰等〔4〕研究显示肾气丸能明显降低肾缺血再灌注损伤小鼠模型中肾组织细胞的凋亡率,改善实验动物的肾功能,发挥肾脏保护作用。但是有关肾气丸在肾间质纤维化中的作用的报道较少。转化生长因子(TGF)-β1/果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白家族(Smad)3信号是细胞内最重要的促纤维化转导通路,能被肾组织中血管紧张素(Ang)Ⅱ等蛋白的表达激活〔5〕,Smad3磷酸化后将纤维化信号传递入核,进一步放大纤维化进程。本研究以腺嘌呤诱导构建大鼠肾间质纤维化模型,基于TGF-β/Smad3信号,探讨肾气丸对疾病进展中相关蛋白表达的影响,希望为药物的临床应用增加新的事实依据。

1 材料和方法

1.1试验动物、主要试剂及仪器 SPF级,6～8周龄,SD大鼠,雄性,40只,体质量200～250 g,购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2020-0007,经医院专门人员在温度20～25 ℃,湿度55%～60%,12 h明暗交替的条件下进行适应性喂养后用于实验。本研究的实验操作和目的已经获得医院动物伦理委员会的批准。肾气丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,国药准字:Z11020147);过表达TGF-β1(pcDNA3.1-TGF-β1)及阴性对照(pcDNA3.1-TGF-β1-NC)购自北京安波特基因工程技术有限公司。腺嘌呤(北京中杉金桥生物技术有限公司),苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、Masson染色试剂盒、Western印迹试剂盒(南京建成生物科技有限公司),兔抗大鼠AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3抗体及磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国abcam公司。X71光学显微镜、JEM-300F2透射电镜(日本Olympus公司),凝胶自动成像系统(美国Bio-rad公司),组织包埋机、摊片机、超薄切片机(德国Leica公司)。

1.2动物模型的复制及分组处理 肾间质纤维化大鼠模型的复制根据Contreras-Salinas等〔6〕介绍的方法:每日以250 mg/kg的腺嘌呤生理盐水混悬液进行灌胃处理,每日1次,连续12 d后,更换为每两日1次,连续12 d,造模周期共24 d。动物随机分为正常组、模型组、实验组和过表达组,正常组造模过程中以等剂量的生理盐水进行灌胃处理。大鼠造模周期结束后,实验组每日尾静脉注射5×109pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC,并且以10 g/kg的肾气丸进行灌胃处理;过表达组每日尾静脉注射5×109pfu/ml pcDNA3.1-TGF-β1,并且以10 g/kg的肾气丸进行灌胃处理;模型组和正常组每日尾静脉注射5×109pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC并以生理盐水进行灌胃处理。实验过程中大鼠单笼饲养,自由饮食。

1.3各组肾功能检测 在实验过程中观察记录各组大鼠日常行为的变化,持续给药14 d后,将大鼠诱导麻醉,腹主动脉采血5 ml,置于台式高速微量离心机上10 min,留取上清液,酶标仪检测各组大鼠血清中血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的含量。

1.4各组肾脏组织病理学改变 采血完毕,处死实验动物,无菌操作台上取出大鼠的肾脏组织,医用生理盐水清洗,肉眼观察后,迅速转移至低温冰箱中保存待测。取大鼠的肾脏组织,经固定,脱水,切片,依次HE染色、过典酸雪夫染色(PAS)、Masson染色,镜检。

1.5各组肾脏组织的超微结构改变 取大鼠的肾脏组织,戊二醛固定1 h,PBS清洗,锇酸再固定,梯度浓度的无水乙醇梯度脱水,包埋,切片,醋酸铀-柠檬酸铅双染色JEM-300F2透射镜下观察。

1.6各组肾脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)的表达 取大鼠的肾脏组织,经固定、脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、抗原修复后,按照免疫组化试剂盒要求依次加入一抗(1∶300),二抗(1∶1 000),苏木素复染,封片,镜检,以胞质中出现棕黄色颗粒为目标蛋白阳性表达,ImageJ软件统计分析蛋白的阳性表达率。

1.7各组肾组织中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达水平 取各组大鼠的肾组织,在4 ℃裂解液中放置30 min,离心,并将上清液稀释,常规方法提取样本中的总蛋白,以50 μg样品进行上样,电泳后,转模,封闭,加入一抗(1∶1 000),二抗(1∶5 000)稀释后,室温孵育后,显色30 min,以GAPDH为参照,分析目标蛋白的灰度值。

1.8统计学分析 采用SPSS16.0软件进行单因素分析、t检验。

2 结 果

2.1各组一般状态观察 实验过程未出现大鼠死亡;正常组活动正常,皮毛光亮,进食与饮水正常,大鼠体质量增加明显;模型组活动量较少,易怒,饮食与进水意愿不强烈,皮毛暗淡杂乱,体质量未见明显增加;实验组临床症状明显好转,体质量增加量较模型组明显升高;过表达组饮食量较实验组明显减少,体质量增加较实验组明显降低(P<0.05),见表1。

表1 各组实验前后体质量

2.2各组肾功能的变化 与正常组相比,模型组、实验组、过表达组血清Scr、BUN含量明显升高(均P<0.05);与模型组相比,实验组、过表达组血清Scr、BUN含量明显降低(均P<0.05);与实验组相比,过表达组血清Scr、BUN含量明显升高(均P<0.05),见表2。

表2 各组肾参数、肾组织中α-SMA和ColⅣ阳性细胞的比例及AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的相对表达比较

2.3各组肾脏组织中α-SMA和ColⅣ表达 免疫组化结果显示,与正常组相比,模型组、实验组、过表达组肾组织中α-SMA和ColⅣ阳性细胞比例明显升高(P<0.05);与模型组相比,实验组、过表达组肾组织中α-SMA和ColⅣ阳性细胞比例明显降低(P<0.05);与实验组相比,过表达组肾组织α-SMA和ColⅣ阳性细胞比例明显升高(P<0.05),见表2、图1。

图1 各组肾组织中ColⅣ、α-SMA表达(免疫组化染色,×400)

2.4各组肾脏解剖学、组织损伤病理、超微结构变化 肉眼观察结果显示,正常组肾组织颜色较深,表面光滑,有弹性;模型组肾组织比正常组肾组织个体上偏大,颜色较浅,呈现淡白色,肾组织表面出现结晶沉淀和较多的肾结石,表面粗糙,失去弹性,质地偏硬;实验组肾组织个体较模型组偏小,趋于正常,质软,表面光滑;过表达组肾组织个体较实验组肾组织偏大,质地偏硬,表面偶有白色斑点,见图2。HE染色显示,正常组肾组织肾小管及肾小球形态规则,未见炎性浸润;模型组肾小管扩张明显,肾小球严重硬化和炎性细胞大量浸润;实验组肾小管肿胀,明显缓解,炎性浸润缓和;过表达组组织损伤较实验组重,较模型组轻。PAS染色显示,正常组肾组织肾小管及肾小球结构正常,肾小管与间质及肾小球与间质形态未见明显异常;模型组肾小球基底膜增厚明显,系膜增生严重,系膜区明显变宽;实验组较模型组明显改善,但过表达组较实验组改善程度明显减小。Masson染色显示,正常组肾组织中未见胶原沉淀沉积,无肾间质纤维化现象;模型组肾小球和肾小管中均可见成片的纤维性蓝色沉淀,间质纤维化严重;实验组肾组织蓝色沉积明显减少,间质纤维化现象明显改善;与实验组相比,过表达组肾间质纤维化现象明显加重。电镜观察结果显示:正常组肾小管和肾小球结构完整,足突细胞排列整齐,未见异常;模型组肾小球系膜增厚明显,细胞间质增宽,胞质中细胞器出现空泡样变性,肾小管扩张,可见较为明显的纤维化区域,足突细胞融合严重;实验组肾组织的超微结构损伤明显缓解,肾小球系膜增生趋于缓解,肾小管稍见肿胀;与实验组相比,过表达组肾组织细胞超微结构损伤明显加重,见图3。

2.5各组肾组织中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3表达水平 与正常组相比,模型组、实验组、过表达组肾组织中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达明显升高(均P<0.05);与模型组相比,实验组、过表达组肾组织中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3表达明显降低(均P<0.05);与实验组相比,过表达组肾组织中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达明显升高(均P<0.05),见表2、图4。

图4 各组肾组织中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3蛋白表达

3 讨 论

祖国传统医学在漫长的历史进程中,积累了丰富的治疗肾病及肾纤维化等肾脏疾病的经验,中医认为“肾”主元气,“肾气”足而精力充沛,在中医“阴阳配伍”和肾脏阴阳调和的指导下,涌现了大量的相关治疗名方,如养阴活血方、肾炎防衰液、肾消康、延肾胶囊、通络方等。古方肾气丸出自我国著名医学家张仲景《伤寒杂病论》中的《金匮要略》,主要由肉桂、附子、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻及山茱萸、熟地黄等八味中药,将温阳与滋阴相结合,发挥补肾助阳、阴中求阳,鼓舞肾气的目的。肾气丸配伍严谨常用于顽固性失眠,虚劳腰痛等病症的治疗,并取得了良好的疗效〔7,8〕。刘瑞萍等〔9〕将肾气丸用于阴阳两虚糖尿病肾病的临床治疗中,结果显示该方的应用能明显降低患者的尿蛋白的排泄,降低炎性因子的释放,缓解患者的脏器损伤,改善其肾功能。本研究结果显示实验组大鼠的临床症状,肾组织的病理损伤,纤维化程度、肾组织细胞的超微结构损伤均明显缓解,证实了药物对疾病的干预作用。

TGF-β1是目前已知的具有最强致纤维化效用的细胞因子之一,在肾、心、肝、肺等脏器纤维化进展过程中发挥关键的调控作用〔10〕。Geng等〔11〕研究显示在单侧输尿管梗阻模型小鼠中抑制TGF-β1的表达,抑制TGF-β1/Smad3信号的激活,能明显降低实验动物肾组织中间充质细胞标志物α-SMA的表达,下调ColⅣ导致脏器中的胶原沉淀比例。本研究以腺嘌呤作为诱导剂,该含氮杂环化合物在体内特异性酶的作用下,生成2,8-二羟基腺嘌呤致使肾组织中氮质化合物代谢异常,肾小管发生阻塞,动物的肾功能异常,血清中的过饱和尿酸刺激血管中血管活性肽(主要是AngⅡ的表达升高),激活TGF-β1,诱发大鼠肾间质纤维化〔12〕。本研究以过表达pcDNA3.1-TGF-β1作为对照,过表达组改善情况较实验组明显变差,证实了药物的作用靶点。

综上,肾气丸能减轻肾间质纤维化大鼠肾组织的病理损伤,改善其肾功能,这与抑制TGF-β1/Smad3信号的激活有关。但是将肾气丸全面用于疾病的临床治疗,需要更为详尽、系统的研究。