右美托咪定对大鼠坐骨神经阻滞血流动力学、疼痛及NF-κB表达的影响

唐楠 杜平均 杨红亮 高学锋 王朝阳

(河北省第七人民医院(河北中医学院第二附属医院),河北 定州 073000)

局部麻醉是指患者在神志清醒状态下,将局部麻醉药应用于身体的某一部位,使作用部位周围的神经感觉功能暂时阻断,保持机体功能正常〔1〕。坐骨神经阻滞是局部麻醉之一,将局麻药注射至坐骨神经旁,暂时地阻滞坐骨神经的传导功能,达到坐骨神经所支配区域手术无痛〔2〕。坐骨神经由腰4至骶3前支组成,是身体最粗大的神经,位于臀大肌的深面,经股骨大转子和坐骨结节之间下降至大腿后面,主要支配小腿和足。坐骨神经阻滞穿刺点常取梨状肌与上孖肌之间,主要阻滞方法有侧卧位坐骨神经阻滞法和平卧位坐骨神经阻滞法〔3,4〕。相对其他麻醉,局部麻醉优势较多,其操作简单、方便、安全、并发症少,麻醉状态下患者神志清醒,对患者全身生理功能影响较小。右美托咪定(DEX)属咪唑类衍生物,是α2-肾上腺素受体激动剂美托咪定的右旋异构体〔5〕。DEX在临床中的应用效果良好,DEX α2/α1受体活性较高,具有中枢性抗交感作用,可以产生近似睡眠的镇静作用,还具有一定的镇痛、利尿、抗焦虑作用,对机体的呼吸无明显的抑制作用,对心、脑、肾等功能器官还具有一定的保护作用,适用于手术及重症患者的麻醉〔6〕。核转录因子(NF)-κB广泛存在于细胞中,能和多种细胞基质的启动因子结合,在免疫调控、炎症、应激反应中起重要作用。但是DEX对大鼠坐骨神经阻滞的血流动力学、疼痛及NF-κB的研究较少,本文探讨DEX对大鼠坐骨神经阻滞的血流动力学、疼痛及NF-κB的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 36只SD大鼠,由南京君科生物工程公司提供,体质量190～220 g,温度(22±1) ℃,分4笼饲养,湿度45%～55%,大鼠活动饮水自由,术前禁食12 h,自由进水,严格按照《实验动物管理条例》规定进行实验,实验方案经河北省医学院动物实验伦理委员会批准(批准编号为2018012),动物许可证号:SYXK(苏)2018-0010。

1.2药物、试剂与仪器 DEX(深圳海思安生物技术公司)、罗哌卡因(北京德航五洲科技)、台式离心机(上海力申科学仪器制造厂)酶标仪(上海研卉生物科技)、化学发光成像仪系统(上海易孛特生命科学公司)、电泳仪(上海百赛生物技术公司)、BCA蛋白检测试剂(上海雅吉生物科技公司)

1.3建模及分组 分组:用随机法将36只大鼠分为假手术(SO)组、DEX低浓度(DLC)组、高浓度(DHC)组、罗哌卡因(ROP)组。建模:采用戊巴比妥钠经大鼠腹腔内注射麻醉,麻醉完全后,将大鼠固定于鼠架台上,俯卧位,备皮,消毒。操作的整个过程中,严格无菌,在大鼠右侧股后外侧行纵行切口,自股二头肌与半腱肌、半膜肌之间剪开结缔组织,钝性分离股二头肌与半腱肌,暴露坐骨神经〔7〕。

1.4干预方法 建模成功后,DLC组和DHC组分别给予DEX10、20 μg/kg注射到大鼠坐骨神经周围,ROP组给予0.5%罗哌卡因0.3 ml注射到大鼠坐骨神经周围,SO组给予等容量生理盐水。

1.5大鼠行为学观察

1.5.1机械性缩足反射阈值(PWT)检测 将各组大鼠放入笼内,笼内箱底为金属网板的丙烯酸,大鼠适应30 min左右,纤维丝持续刺激大鼠后足,每次重复测量3次,取平均值,为了避免组织损伤,刺激时间为(5±1)s,观察大鼠反应,记录大鼠受袭击后是否出现撤足或者舔足反应,出现则为阳性,记录阳性反应时,最小纤维丝刺激力大鼠后肢PWT。

1.5.2大鼠后足伸姿推力(EPT)测量 将大鼠直立上提,保持后足伸展姿势,以便远端足趾和足尖支撑体重,然后置于电子称上方,大鼠后足伸展所显示的克数即为大鼠EPT,推力变小表明因运动阻滞导致伸肌收缩力减弱。

1.6血流动力学指标检测 大鼠麻醉后,将股动脉插管通过压力传感器链接于生物信号采集处理系统,将电极插入动物四肢皮下,连接好导线,经过左心室插管记录左心室收缩曲线,计算左心室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP),左心室最大收缩速率(+dp/dt),左心室最大舒张速率(-dp/dt)。

1.7标本采集 用1%戊巴比妥钠麻醉处死各组大鼠,取各组注射部位坐骨神经,用4%多聚甲醛液固定24 h。

1.8苏木素-伊红(HE)染色观察各组坐骨神经病理学变化 取出已经固定好的坐骨神经,石蜡包埋,梯度酒精脱水,透明,浸蜡包埋,取出蜡块,切片取4 μm厚度。用二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,水洗5 min,置于苏木素染色10 min,冲洗,置于伊红染色10 min,再次梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下观察坐骨神经排列及形态、轴突等。

1.9TUNEL法检测各组坐骨神经凋亡 取坐骨神经组织,切片浸入TUNEL反应液中,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。过氧化氢冲洗淬灭酶活性,后联合抗生物蛋白过氧化氢酶和二氨基联苯胺覆盖,光学高倍显微镜下进行观察凋亡细胞核呈现棕黄色,随机选择5个视野下的细胞观察凋亡率。

1.10Western印迹检测坐骨神经中NF-κB、白细胞介素(IL)-6水平 坐骨神经组织样本经液氮研磨之后,加入400 μl裂解液,充分混匀。4 ℃放置60 min后,4 ℃离心15 min后收集上清。将获得的总蛋白用二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测,测定蛋白浓度。100 ℃沸水加热处理 5 min,使蛋白充分变性,离心5 min,取上清备用。分离胶与5%浓缩胶,每孔上样60 μg,恒压100 V跑电泳90 min,待溴酚蓝到达胶底部时,停止电泳。恒压将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下用5%脱脂奶粉的封闭液,封闭转印膜1 h,然后TBST洗3次,5 min/次。加入一抗NF-κB(1∶500)、IL-6(1∶500)过夜孵育。TBST漂洗3次后,用辣根过氧化物酶耦联二级抗体山羊抗兔 IgG(1∶5 000)在室温下再次孵育1 h,TBST漂洗3次后,浸入电化学发光(ECL)工作液,检测,显色等步骤,成像系统对印迹条带的光密度进行分析。GAPDH作为内参。

1.11统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析或重复测量方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组PWT比较 与SO组相比,ROP组、DLC组及DHC组在0～2.0 h各时间段PWT值均明显升高(P<0.05);与ROP组相比,DLC组及DHC组0.5～3.0 h时间段PWT值均明显升高(P<0.05),DHC组0.5～3.5 h各时间段PWT值明显高于DLC组(P<0.05),见表1。

表1 各组PWT比较

2.2各组EPT比较 与SO组相比,ROP组、DLC组及DHC组0～2.0 h各时间段EPT值明显降低(P<0.05);与ROP组相比,DLC组及DHC组0.5～3.0 h时间段EPT值明显降低(P<0.05),DHC组0.5～3.5 h时间段EPT值明显低于DLC组(P<0.05),见表2。

表2 各组EPT水平比较

2.3各组血流动力学比较 与SO组相比,ROP组、DLC组及DHC组LVEDP、LVSP、+dP/dt、-dP/dt明显升高(P<0.05);与ROP组相比,DLC组、DHC组LVEDP、LVSP、+dP/dt、-dP/dt明显升高(P<0.05);与DLC组相比,DHC组血流动力学指标显著升高(P<0.05),见表3。

表3 各组血流动力学及炎性指标比较

2.4各组炎性因子NF-κB、IL-6蛋白表达 与SO组相比,ROP组、DLC组及DHC组坐骨神经组织中NF-κB、IL-6蛋白表达明显升高(P<0.05);与ROP组相比,DLC组和DHC组NF-κB、IL-6蛋白表达明显下降(P<0.05);DHC组坐骨神经组织中NF-κB、IL-6蛋白表达明显低于DLC组(P<0.05),见表3、图1。

图1 各组NF-κB、IL-6蛋白表达

2.5各组坐骨神经HE染色结果 SO组坐骨神经外膜完整,神经纤维排列紧密、整齐,形态正常,染色均匀,轴突及髓鞘结构清晰;ROP组部分坐骨神经纤维排列紊乱、连续性中断,部分轴突、神经鞘膜水肿;DLC组神经纤维结构紊乱、连续性中断现象明显减少,轴突水肿,神经纤维髓鞘水肿; DHC组坐骨神经纤维排列较整齐,神经轴突轻度水肿,见图2。

图2 各组坐骨神经病理变化(HE染色,×200)

2.6各组坐骨神经细胞凋亡率的比较 与SO组坐骨神经细胞凋亡率〔(6.91±1.48)%〕相比,ROP组〔(26.31±1.39)%〕明显升高(P<0.05);与ROP组相比,DLC组〔(19.34±1.78)%〕明显下降(P<0.05);DHC组坐骨神经细胞凋亡率〔(13.25±1.57)%〕明显低于DLC组(P<0.05),见图3。

图3 各组坐骨神经细胞凋亡(TUNEL染色,×200)

3 讨 论

局部麻醉相比全身麻醉具有一定独特性,局麻药的作用一般局限于给药部位,且随药物扩散而迅速消失。研究表明,DEX有较好的降低应激反应、维持血流动力学稳定,预防术后谵妄的效果,能够有效改善术中缺血对器官组织的损伤,DEX可能通过抑制肾上腺素的释放,调节机体免疫〔8～10〕。

血流动力学指标是真实反映机体应激状况的有效评价指标,能较好地反映心脏的功能,LVSP主要反映心肌的收缩能力,LVEDP代表左心室前负荷,间接反映心室的舒张顺应性。+dp/dt在一定程度伤反映室壁张力的变化速度,它受心脏的前后负荷影响较大,分别反映收缩期和舒张期心肌的收缩功能。本研究结果提示,DEX可以改善血流动力学的异常,维持血流动力学的稳定。杨百武等〔11〕通过对子宫切除术的患者进行研究发现,通过应用DEX,患者的血流动力学更加稳定,可以降低应激反应,减少麻醉药的用量,术后患者效果也较好。DEX主要作用蓝斑核,可抑制去甲肾上腺素的释放,终止疼痛信号的传导。蓝斑作为该系统的中枢位点,受到DEX作用后产生类似自然睡眠,起到抗焦虑镇静作用,同时抑制了交感神经兴奋和肾上腺髓质兴奋,减少了去甲肾上腺素和肾上腺素的释放,使血流动力学更加稳定〔7〕。

术后疼痛可刺激机体呈现应激状态并分泌大量糖皮质类与儿茶酚胺类激素,进而诱发多种炎性因子释放,术后疼痛本身亦会产生大量炎性因子。DEX最初运用于临床时,仅运用其镇静、镇痛作用,研究者们逐渐发现其还有抗炎、抗焦虑等作用,因此DEX在临床应用的也逐渐增多。DEX可能通过维持颅内压平衡,减少脑代谢、脑血流,减少炎症介质及神经内分泌激素释放,降低脑耗氧量,从而保护神经系统〔12〕。研究表明,DEX具有抗炎作用,能够抑制TNF-α、IL-6等多种炎性因子的产生,并对心脑肝等器官有保护作用〔13〕。NF-κB的过度活化可上调多种炎性因子的基因转录,间接激活机体的特异性免疫反应,造成组织和器官的功能紊乱。夏继辉等〔14〕研究发现脓毒症大鼠体内的炎性因子NF-κB、IL-6水平明显升高,而经过DEX干预后脓毒症大鼠体内的炎性因子水平明显下降,减轻炎性因子介导对心脏的损伤,维持大鼠体内血流动力学稳定,说明DEX不但可以抑制炎性因子的表达还可以维持血流动力学稳定。DEX抑制突触末梢神经递质的释放,从而产生镇静作用。研究表明,DEX可以抑制巨噬细胞和单核细胞炎性因子IL-6、NF-κB等分泌,具有抗炎症反应和抗交感神经活性作用,可以明显抑制炎症反应。本研究结果表明,DEX可抑制炎性水平。

DEX用于神经阻滞是近年来提出的一个比较新颖的药物,其能通过激动脊髓突触前膜和后膜α2受体,从而使细胞产生超级化,抑制疼痛信号。有学者认为促炎因子的释放可能和疼痛有关。研究发现,在局麻药中加入DEX,发现其阻滞时间可以延长,且所有患者在术中及术后均未出现严重的不良反应〔15〕。王玉嘉等〔16〕发现,DEX联合阿片类药物舒芬太尼用于剖宫产术后的镇痛,不仅可以显著延长镇痛时效,还可以明显的降低产后抑郁评分(EPDS),减轻患者产后抑郁程度,降低产后抑郁的发生率,减少阵痛药物使用剂量。本研究结果说明,经过DEX干预后神经阻滞在感觉和运动方面均有延长,其中感觉延长时间更为明显。研究证实,DEX可以预防麻醉药如异氟烷、氯胺酮等所导致的中枢神经毒性,减轻神经元凋亡,保护脑功能〔17,18〕。有研究〔19〕发现,DEX可以通过抑制 p38MAPK 信号通路的激活,对神经细胞凋亡进行抑制,从而减轻了丁哌卡因的脊髓神经毒性。本研究与上述研究一致。

综上,DEX维持坐骨神经阻滞大鼠的血流动力学稳定,抑制NF-κB、IL-6炎性因子表达,发挥阵痛效果,对神经细胞具有保护机制。