补肾益智方对SAMP8小鼠海马和内嗅皮层神经元修复及突触可塑性的影响

张彩霞 周泰冰 陈丹丹 接琳琳 卢强 吴君

(山东中医药高等专科学校,山东 烟台 264199)

阿尔茨海默病(AD)是一种随着年龄增长认知功能逐渐下降最终导致死亡的神经退行性疾病,好发于65岁以上的老年人〔1〕,目前尚无有效的治疗方法。中医认为AD的认知功能减退主要与老年衰惫、肾精失充有关。补肾类中药复方具有多靶点、多途径的优势,在延缓脑组织的衰老、改善学习记忆障碍等能力方面有着独特的优势〔2〕。研究表明,连续补肾益智方灌胃的AD模型鼠,脑内兴奋性氨基酸明显降低,而抑制性氨基酸γ氨基丁酸和甘氨酸的含量升高,有预防及缓解记忆力衰退的功效〔3〕。水迷宫实验表明,补肾益智方能显著提高AD模型鼠学习记忆能力〔4〕。生长相关蛋白(GAP)-43和神经生长因子(NGF)均是与轴突生长、突触可塑性和神经修复密切相关的基因〔5,6〕。本研究拟通过观察补肾益智方对7月龄 SAMP8 小鼠海马和内嗅皮层中GAP-43和NGF表达的影响,研究中药复方对神经元的作用机制,以期为中医中药防治AD的临床应用提供更多实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 7月龄快速老化模型SAMP8雄性小鼠90只,7月龄雄性SAMR1小鼠30只,均购自北京华阜康生物科技有限公司,动物许可证号 SCXK(京)2019-0008。SPF级,动物实验室内通风良好,自然光照,室温(22±2)℃。适应性喂养后进行灌胃试验。

1.2实验药物 补肾益智方:熟地黄15 g、枸杞子20 g、山茱萸12 g、盐益智仁6 g、丹参15 g、当归10 g、郁金10 g、石菖蒲10 g、川芎10 g、远志6 g等,以上药物经山东天江药业制成免煎颗粒。补肾益智方剂量设定根据成人临床给药剂量1.34 g/(kg·d)的2倍、4倍确立〔7〕,低剂量〔2.68 g/(kg·d)〕、高剂量补肾益智方药液终浓度〔5.36 g/(kg·d)〕连续灌胃6 w。药液配制完成后放置于4 ℃冰箱冷藏备用,用前37 ℃温水浴后摇匀。

1.3实验试剂 兔抗GAP-43多克隆抗体(ab75810)和兔抗NGF多克隆抗体(ab52918)均购自Abcam公司;荧光素-5-异硫氰酸盐(FITC)标记羊抗兔IgG(111-095-003)购自美国Jackson Immuno Research;TRIzol(15596-026)购自美国Invitrogen公司;cDNA第一链合成试剂盒(RR036B)购自日本TaKaRa,;One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-聚合酶链反应(PCR)Kit Ⅱ(SYBR Green)购自日本TaKaRa,生产批号:RR086B。

1.4给药与取材 将SAMP8小鼠随机分成3组:模型组、补肾益智方低剂量组和补肾益智方高剂量组。对照组为同月龄SAMR1小鼠。补肾益智方低剂量组和高剂量分别给予小鼠终浓度为2.68 g/(kg·d)和5.36 g/(kg·d)补肾益智方药液连续灌胃42 d。模型组和对照组均给予等量生理盐水灌服,乌拉坦麻醉。随机选取部分小鼠经心脏灌注4%多聚甲醛固定,取小鼠大脑,制作石蜡切片,进行免疫荧光染色。一部分剥离小鼠海马和内嗅皮层,TRIzol匀浆器冰上充分匀浆,提取总RNA,一部分提取小鼠海马和内嗅皮层总蛋白。

1.5免疫荧光染色 切片脱蜡,封闭内源性过氧化物酶;37 ℃封闭非特异性抗原。甩去多余血清,滴加一抗兔抗GAP-43(1∶150)或兔抗NGF(1∶200),将切片置于湿盒,孵育过夜(4 ℃)。滴加荧光二抗(1∶400),37 ℃,避光孵育50 min;4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染,将切片置于暗盒,孵育5 min。荧光防淬灭封片剂封片。激光共聚焦显微镜观察、摄片。

1.6RT-PCR 分别提取小鼠海马和内嗅皮层总RNA,进行RT-PCR实验,实验步骤参照Zhou等〔8〕。扩增条件:预变性95 ℃,5 min;变性95 ℃,15 s,58 ℃退火20 s,延伸72 ℃,40 s,进行40循环;95 ℃,8 min。引物序列:GAP-43上游引物:5′-GCTGTGCTGTATGAGAAGAACC-3′,下游:5′-AATTTTGGT-CGCAGCCTTATGA-3′;NGF上游引物:5′-GTCTGG-GCCCAATAAAGGTTTT-3′,下游:5′-GAAGTTTAGT-CCAGTGGGCTTC-3′;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游引物:5′-GAAGGTGGTGAAGCAGGCATCT-3′,下游:5′-CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG-3′。

1.7Western印迹检测 分别提取小鼠海马和内嗅皮层组织总蛋白。十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),转膜,5%脱脂奶粉溶液室温封闭60 min;一抗(兔抗GAP-431∶15 000或兔抗NGF1∶12 000),4 ℃过夜;羊抗兔二抗(1∶5 000)37 ℃摇床孵育55 min;电化学发光(ECL)反应3 min,暗室胶片曝光。

1.8统计学处理 采用SPSS20.0软件进行t检验。采用ImageJ图像分析光密度值。

2 结 果

2.1GAP-43定位于海马和内嗅皮层区且补肾益智方灌胃后表达升高 各组大脑切片的海马和内嗅皮层区中均可检测到GAP-43阳性细胞。与对照组比较,模型组海马区和内嗅皮层中GAP-43 平均光密度值、mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,补肾益智方低剂量组与高剂量组海马区和内嗅皮层中GAP-43 平均光密度值、mRNA及蛋白表达均显著增强(P<0.01,P<0.05)。与补肾益智方低剂量组比较,补肾益智方高剂量组海马区和内嗅皮层中GAP-43平均光密度值、mRNA及蛋白表达虽有升高,但差异无统计学意义(均P>0.05)。见图1、图2、表1、图3、图4。

表1 各组海马区及内嗅皮层GAP-43免疫阳性细胞平均光密度值、mRNA和蛋白表达比较

图1 各组海马区GAP-43表达(免疫荧光,×400)

图2 各组内嗅皮层GAP-43表达(免疫荧光,×400)

1～4:对照组、模型组、补肾益智方低剂量组、补肾益智方高剂量组;图4同

图4 Western印迹检验各组内嗅皮层GAP-43和NGF蛋白表达

图5 各组海马区NGF表达(免疫荧光,×400)

2.2NGF定位于海马区且补肾益智方灌胃后表达升高 补肾益智方灌胃42 d后,各组海马区和内嗅皮层切片中均可检测到NGF阳性细胞。与对照组比较,模型组海马区和内嗅皮层中NGF平均光密度值、mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,补肾益智方低剂量组与高剂量组海马区和内嗅皮层中NGF平均光密度值、mRNA及蛋白表达均显著增强(P<0.01,P<0.05)。与补肾益智方低剂量组相比,补肾益智方高剂量组海马区和内嗅皮层中NGF平均光密度值、mRNA及蛋白表达虽有升高,但差异无统计学意义(均P>0.05)。见图3～图6、表2。

表2 各组海马区及内嗅皮层NGF免疫阳性细胞平均光密度值、mRNA和蛋白表达比较

图6 各组内嗅皮层NGF表达(免疫荧光,×400)

3 讨 论

AD可影响人体多个系统,随着病情加重,会导致患者失去自主生活能力并带来严重的并发症,最终死亡。研究发现,内嗅皮层是AD患者大脑中最早最明显的受损区,AD早期内嗅皮层中会出现神经元凋亡、神经纤维缠结、淀粉样斑块和突触损伤丢失等现象,随后逐渐扩展至海马等周围结构〔9〕。内嗅皮层连接海马与新皮层,被称为皮层记忆的枢纽,内嗅皮层神经元在记忆的恢复中起着重要作用〔10〕。神经元的记忆功能活动需要依靠突触连接来实现,因此突触的损伤或缺失是影响认知功能神经生物学的重要因素〔11〕。

GAP-43是一种在大脑海马中表达丰富的磷蛋白,可影响神经发育和突触重塑。在正常海马和记忆相关区域,GAP-43高水平表达,而GAP-43缺失会导致小鼠空间记忆功能障碍〔12〕。当神经系统受损时,损伤部位周围的神经元可通过反应性轴突和侧枝再生进行补偿。受损区域中的GAP-43表达水平随损伤修复时间的增加而增加,然后逐渐降低。因此,GAP-43被认为是研究神经可塑性、修复和再生的首选探针〔13〕。本实验两组海马区和内嗅皮层中均检测到GAP-43阳性细胞的存在。

历代名老中医常以“肾-髓-脑”为轴线,以补肾为先的理念论治AD临床证明可取得满意疗效。补肾益智方中枸杞子、熟地黄和山茱萸可补肾填精,郁金、石菖蒲和远志可活血化痰开窍。因此补肾益智方具有补肾益气、活血健脑和开窍醒神的功效,与AD发病机制相契合〔14〕。本实验以补肾益智方饮片为原料,通过现代化制药技术制成免煎颗粒。免煎颗粒不但方便服用而且可以明确地控制质量,能够很好保留中药饮片的药性和药效,在一定程度可以作为中药水煎剂的替代〔15〕。临床实践证明,补肾益智方在老年遗忘型轻度认知功能障碍方面有疗效〔16〕。前期水迷宫实验发现补肾益智方能有效改善6月龄SAMP8小鼠的学习记忆能力〔17〕。本研究结果提示,补肾益智方免煎颗粒可上调GAP-43的表达。GAP-43在大脑突触功能的维持和神经处理中起关键作用,出生1 w时在神经元内表达最高,成年之后除了海马和新皮质区表达较高,脑部其他区域表达较低〔18〕。本研究结果说明,AD的记忆丧失可能与突触的修复或神经功能障碍有关。适度GAP-43蛋白表达,有利于记忆增强,而过度的GAP-43表达反而有可能损伤记忆〔19〕。经过补肾益智方灌胃治疗42 d后,GAP-43蛋白在海马的表达明显高于模型组,这提示上调的GAP-43可能有利于海马区突触修复和神经元再生,进而有改善小鼠学习记忆的作用。

NGF广泛存在于成年人中枢神经系统和周围神经系统,是一种十分重要的神经营养因子,有促进神经元发育、分化、成熟、再生和突触可塑性的作用〔20〕。当皮质和海马区NGF的供应量减少时,基底前脑胆碱能神经元形态和功能出现障碍,导致AD认知功能下降〔21〕。本研究结果提示,补肾益智方可上调SAMP8小鼠海马区和内嗅皮层中NGF,可能与神经元或突触的修复有关。在缺血脑卒中动物模型中,NGF过表达可通过上调GAP-43,使GAP-43稳定性提高,诱导神经元形态和功能恢复,进而缓解动物的认知障碍〔22〕。由此推测,补肾益智方也可能通过上调NGF,提高GAP-43神经元和突触的修复作用,进而改善SAMP8小鼠的认知障碍。本研究发现,不同剂量补肾益智方在GAP-43、NGF蛋白和mRNA表达方面尚未发现明显变化,分析原因可能与所选剂量或实验动物月龄等因素有关。

综上所述,补肾益智方免煎颗粒可通过改善SAMP8小鼠海马区和内嗅皮层中GAP-43、NGF蛋白和mRNA表达,减轻其空间学习记忆功能损伤,这可能与其调控神经元修复和轴突可塑性密切相关,具体机制有待深入研究。