野菊花颗粒对COPD模型大鼠气道炎症与重塑及MMP-9/TIMP-1平衡的影响

黄勇 苏韫 龚红霞 曾元丁 李春波 李婷婷

(甘肃中医药大学甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室,甘肃 兰州 730000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病主要机制中慢性炎症起重要作用,其中慢性发炎所导致的气道重塑也是最主要的疾病特征之一。慢性气道炎症和气道重构变化由许多原因引起,导致不断出现的呼吸系统体征和气流问题受限〔1～3〕。研究证实,基质金属蛋白酶(MMP)-9在胞外基质破坏中发挥重要作用,促使细胞外基质(ECM)大量堆积,并引起气道重塑〔4,5〕。MMP组织抑制因子(TIMP)-1为MMP-9的抑制剂,能够特异性控制MMP-9,而MMP-9/TIMP-1平衡在COPD发生机制中起关键调节作用。本实验通过现代制剂工艺技术提取野菊花有效成分,制备野菊花颗粒,观察野菊花颗粒对COPD大鼠气道炎症反应及MMP-9、TIMP-1表达的影响,探讨野菊花颗粒在治疗COPD中的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 SPF级Wistar大鼠72只,雌雄各一半,体质量180～220 g〔甘肃中医药大学科研实验中心,动物质量检测合格证编号:62001000000165;许可编号:SCXK(甘)2011-0001〕。各组适应性喂养3 d,随机分为空白组,模型组,醋酸泼尼松(阳性对照)组,野菊花颗粒高、中、低剂量组。

1.2野菊花颗粒制备方法〔6〕称重选取野菊花中药材,在药材中加入12倍的纯水。先使用蒸馏法将药材放入水蒸气中5用于提取挥发油,再采集挥发油。将药渣与水提液两者滤过分开,保留其中的水提液,在滤出的药渣中再加入8倍的水回流萃取1 h,过滤得到水提液,水提液合并后浓缩至相当于最初药材量质量比的5倍,加入一定量的乙醇静置至60%沉淀,在经过高速离心后,吸取上清液减压浓缩到需要的浓度。在之前提取的挥发油中加入泊洛沙姆188研磨均匀后再加入少量的浓缩药液制作成初乳。而野菊花提取液是由挥发油初乳加上浓缩药液混匀构成。浓缩至稠膏状(药物相对密度为D1.40,即每毫升浓缩液里含药物1.40 g),60 ℃ 常压烘干,粉碎至40目成颗粒即可。

1.3模型制备 各组大鼠使用注射器在腹腔注射乌拉坦(1.4 g/kg)麻醉后,将其放置固定于操作台上呈仰卧位,进行消毒,沿气管平行方向剪开颈部,将气管暴露出,使用4号针头刺入气管,空白组注入生理盐水,其余组均注入1 g/L的脂多糖200 μl建立COPD模型〔7,8〕;造模第2天起,空白组和模型组每日灌服等容积生理盐水,给予阳性对照组醋酸泼尼松0.040 5 mg/(ml·d),野菊花低、中、高剂量组分别给予0.7、1.4、2.8 g/(kg·d)野菊花颗粒灌胃,共28 d。

1.4生化法检测支气管肺部组织羟脯氨酸浓度 治疗28 d后,将各组大鼠右侧肺组织取出,结扎支气管,并注入磷酸盐缓冲液(PBS)进行支气管肺泡灌洗,采集灌洗液备用。生化法分别检测支气管肺组织和血清中羟脯氨酸的浓度。

1.5苏木素-伊红(HE)染色法观察各组右肺组织病理学形态 处死大鼠,剖开胸腔,剥离肺组织,将大鼠右肺组织置于4%多聚甲醛固定液中固定,石蜡包埋后进行切片,依次进行梯度二甲苯脱蜡,酒精梯度脱水,苏木素染色,水洗,盐酸酒精,水洗,酒精梯度脱水,伊红染色,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片后在光学显微镜下观察其病理变化。

1.6免疫组织蛋白法检测各组肺组织MMP-9和TIMP-1蛋白表达 将石蜡切片常规脱蜡后清洗3次,3%H2O2封闭10 min,PBS彻底清洗切片3次,每次5 min;然后进行抗原修复,加入一抗,湿盒4 ℃过夜后加入二抗,37 ℃孵育30 min,二氨基联苯胺(DAB)显色,脱水封片后与光学显微镜下观察。蛋白阳性表达显示为细胞内出现棕黄色颗粒。在图像分析系统(CX21 型生物显微镜,日本 OLYMPUS 公司;MiE 图像处理系统,山东易创电子有限公司;BI-2000医学图像分析系统,成都泰盟科技有限公司) 20 倍物镜下,每张切片随机选取 5 个视野,测定肺组织内MMP-9和TIMP-1表达颗粒的积分光密度,取其平均值作为该只大鼠的肺组织MMP-9和TIMP-1蛋白相对表达量。

1.7实时(Real-time)荧光定量PCR检测MMP-9和TIMP-1 mRNA表达 肺组织取材后,提取总RNA,反转录为cDNA。进行PCR,反应条件为:预变性95 ℃ 5 min,变性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 20 s,共循环40次。运用相对表达量2-ΔΔCt法进行数据分析。引物序列(5′→3′):MMP-9正向:CATGCGCTGGGCTTAGATCA,反向:GAGGCCTTGG-GTCAGGTTTAGAG,156 bp;TIMP-1正向:CATCTCTGGCCTCTGGCATC,反向:CATAACGCTGGTATAAGGTGGTCTC,148 bp;GAPDH正向:TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC,反向:AAGATGGTGATGGGCTTCCCG,130 bp。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组羟脯氨酸含量 与空白组比较,模型组羟脯氨酸含量异常增高(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组、野菊花各剂量组羟脯氨酸含量表达均显著减弱(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 各组肺组织羟脯胺酸含量、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白表达比较

2.2MMP-9和TIMP-1蛋白表达 免疫组化结果表明,MMP-9、TIMP-1阳性表达主要位于细胞质,呈棕黄色或黄褐色颗粒。与空白组相比,模型组MMP-9、TIMP-1阳性表达着色较深,光密度值显著升高(P<0.05);与模型组比较,醋酸泼尼松组及野菊花高、中、低剂量组阳性表达着色较浅,光密度值明显降低(P<0.05),见表1、图1。

2.3MMP-9和TIMP-1 mRNA表达 与空白组相比,模型组MMP-9、TIMP-1 mRNA 表达明显增高(P<0.01);与模型组相比,野菊花高、中剂量组和醋酸泼尼松组MMP-9、TIMP-1 mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01),见表1。

2.4大鼠肺组织病理学形态观察 HE结果表明,空白组肺部组织及支气管结构完好,黏膜表面光滑且腺体无增生,管壁各层均无明显炎性细胞浸润,支气管腔内也无渗出物。模型组支气管黏膜上皮出现变性脱落,黏膜层明显充血、水肿,视野中可见炎性细胞大量浸润。与模型组比较,阳性对照组炎症减轻,细支气管腔内可见排出少许分泌物,炎性细胞浸润程度较轻。野菊花高剂量组可见肺组织少量炎性细胞浸润,支气管壁结构完整、黏膜充血显著减轻、腔内无明显分泌物,病变严重程度减低,病变区域缩小。野菊花中剂量组肺组织构造完整,支气管壁增厚不明显,黏液分泌物减少,较少炎性细胞浸润。野菊花低剂量组肺组织病变程度接近模型组,大量炎性细胞浸润,支气管管壁增厚明显,分泌物明显增多,见图2。

3 讨 论

目前普遍认为MMP-9/TIMP-1系统的失衡是COPD发病中气道重塑的主要机制之一。ECM的降解和沉积失衡在COPD发生气道重构、肺实质破坏及间质增生中扮演着重要的角色〔8,9〕。而MMPs在调节ECM代谢中也起到了主要作用。MMP-9作为主要限速酶是MMPs家族的一员,可以保障肺基底膜及其结构支架的完整性、并在合成与降解平衡ECM中起至关重要的作用,与气道重塑发生、发展密不可分〔10〕。在正常组织中MMP-9的表达极低,但是在一定刺激下其表达量升高例如炎性细胞因子。TIMPs能够抑制MMPs的活性,具有改变正常ECM及各种病理过程的作用。其中,TIMP-1能够特异性抑制MMP-9的生物学效应,从而降低基质的降解,主要作用于阻断MMP-9的活化及抑制已活化的MMP-9活性两部分。因此,TIMP-1表达升高代表了气道修复及重塑过程,是气道纤维化的重要标志。在气道进行炎症和重塑的步骤中,MMP-9/TIMP-1系统失衡,会降解大量ECM成分,严重破坏基底膜。MMP-9升高,气道炎症反应增强,导致组织破坏;TIMP-1升高,可以修复气道,导致组织重建。因此在炎症损伤和气道重塑阶段,抑制MMP-9和TIMP-1的过度表达,使MMP-9/TIMP-1系统平衡,成为阻止气道重塑的有效途径之一。

COPD在祖国医学中可归属于“痰饮”“肺胀”“喘证”等范畴,其病位主要在肺,并涉及脾、肾、肝。病因包括吸烟等,吸烟导致人体内津化为痰,得气机运行受阻,生瘀化热〔11〕。COPD急性发作期中医病机主要为痰热夹瘀,治法上以祛痰化瘀,宣肺泄热为主〔12〕。野菊花性凉,味苦、辛,归肺、肝经,具有清热解毒、消散痈肿、疏风平肝之功效。现代药理研究表明,其活性成分主要有黄酮类、挥发油类、多糖、有机酸及微量元素等,具有良好具有抗炎和免疫调节抑菌、抗病毒、抗氧化、肝保护、降血压、降血脂及抗肿瘤等药理作用〔13,14〕。有研究表明〔15〕,野菊花能通过核转录因子(NF)-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路抑制脂多糖诱导的炎性因子产生,从而产生免疫调节作用。

本研究结果表明,结缔组织大量增生与破坏,发生气道结构重建。MMP-9、TIMP-1表达升高,表明气道发生炎症反应和气道重塑。而各治疗组较模型组相比,羟脯氨酸含量下降,MMP-9、TIMP-1表达降低,表明野菊花颗粒对COPD大鼠模型气道炎症与重塑具有抑制作用,野菊花颗粒明显降低了COPD模型大鼠肺组织中羟脯氨酸浓度和MMP-9、TIMP-1的表达水平,从而减轻气道炎症与重塑,为临床用于治疗COPD提供了科学依据。