过氧化物酶体增殖物激活受体-γ对P.acnes诱导的人角质形成细胞焦亡、增殖及凋亡的影响

易莎 胡楠 李粤 杨林 张玉婷 熊霞 钟桂书 陈燕

西南医科大学附属医院皮肤科（四川泸州 646000）

寻常痤疮（acne vulgaris，AV）是常见的慢性炎症性皮肤疾病。在我国，此病的发病率约为39.2%，多发生于青少年［1］。皮损主要表形为颜面及胸、背部泛发丘疹脓疱、囊肿结节，部分严重者因其损害大、难治愈、易反复、常遗留瘢痕，可引起患者出现多种心理障碍，给患者带来沉重的心理负担和精神压力［2］。痤疮的发病机制尚未完全明了，主要认为与皮脂腺导管的过度角质化（皮肤角质形成细胞过度增殖）、痤疮丙酸杆菌（Propionibacteriumacnes，P.acnes）和炎症、皮脂腺细胞的皮脂分泌失调（皮脂过度分泌或脂质成分改变）等四大因素有关［3-6］。目前多种方法用于痤疮治疗，例如局部治疗、口服抗菌药物及维 A 酸类药物、激光治疗和饮食干预等，但其病情极易反复，长期使用这些方法可能会导致治疗抵抗甚至产生其自身无法克服的副作用［7］。因此，进一步研究痤疮的发病机制对于临床改善痤疮治疗效果的至关重要。

细胞焦亡是机体重要的免疫反应及一种新型的程序性调控的细胞死亡方式，具有促炎效应，并伴随细胞膜破裂、细胞崩解。过度的细胞焦亡在导致细胞死亡的同时，释放炎症因子，扩大炎症反应，参与多种疾病的发生［8］。LI 等［9］发现，抑制NLRP3 介导的焦亡作用，可以改善抑郁症。ZHAO 等［10］证实高血糖相关的巨噬细胞焦亡加速了牙周炎症的发展。研究表明，痤疮丙酸杆菌影响的皮肤角质形成细胞，通过产生炎症反应，参与痤疮的进程。然而，细胞焦亡是否参与了AV 的发生发展，及其发挥的作用机制尚未明确。

过氧化物酶体增殖物激活受体（eroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）主要由：PPARα、PPAR-β/δ以及PPAR-γ构成。研究发现，PPAR-γ及其靶基因在角质形成细胞中表达，发挥保护细胞免受病原菌诱导的炎症损伤的作用［11］。也有研究报道，PPAR-γ 可通过ROS/TXNIP/NLRP3 通路发挥对肝细胞的抗细胞焦亡保护作用［12］。目前认为，抗细胞焦亡作用尤为关键［13］。而PPAR-γ 在痤疮中是否通过影响P.acnes诱导的细胞焦亡，从而影响痤疮毛囊导管结构中重要组成部分-角质形成细胞的增殖和炎症反应尚未阐明。

本研究中拟检测PPAR-γ在痤疮组织中的表达，并使用正常人永生化表皮角质形成细胞系HaCaT作为研究对象，探索PPAR-γ是否可以调节P.acnes诱导的细胞焦亡，细胞增殖和凋亡从而减轻炎症反应。

1 材料与方法

1.1 组织样本本研究工作经过了西南医科大学附属医院伦理委员会的批准；所有参与者都提供了书面的知情同意书。在西南医科大学附属医院皮肤科门诊病理检查中，采集4 例痤疮背部皮损标本，4 例正常背部皮肤组织作为对照。

1.2 细胞培养正常人永生化表皮角质形成细胞系HaCaT（中国科学院昆明细胞生物所）。培养基含有10%胎牛血清（四季青，Invitrogen 公司），高糖培养基（DMEM，Gibico）和1%青霉素链霉素（Invitrogen）。培养于5% CO2，37 ℃细胞培养箱中。

1.3 慢病毒转染使用重组慢病毒（吉玛，中国上海），包含PPAR-γ质粒（LV-PPARγ）和阴性对照，转染HaCaT细胞系过表达PPAR-γ。使用靶向PPAR-γ基因（5'-CTGCGGAGCCCTTTGGTGACTTTATGGACAATCTGCCTGAGGTCTGTCATCTTCT-3'）［14］。转染前，细胞（2×105个细胞/孔）在12 孔板中培养。在达到50%汇合后，用慢病毒以50的感染复数（MOI）转染HaCaT 细胞。在含有1 μg/mL 嘌呤霉素（Invivogen）的培养基中选择稳定转染的细胞。通过Western blot 分析确定基因的过表达效率。

1.4 分组和处理使用或不使用1×107CFU/mLP.acnes分别处理HaCaT 细胞12、24、48、72 h 后，检测HaCaT细胞中的IL-1β和IL-18水平。分别使用（P.acnes+LV-PPARγ 组）和（P.acnes+LV-PPARγ-NC组）转染HaCaT细胞48 h，再使用1×107CFU/mLP.acnes处理24 h 后，进行后续的实验。

1.5 ELISA法检测IL-1β、IL-18使用ELISA试剂盒（R＆D Systems 公司）对HaCaT 细胞上清液炎性因子IL-1β和IL-18 水平进行检测，将细胞上清液稀释到100 μL（1∶20），步骤严格按照说明书进行操作，使用酶标仪（Bio-Rad，Hercules）在450 nm 处读取吸光度值。

1.6 EdU 细胞增殖检测使用EdU 细胞增殖检测试剂盒（索莱宝，中国上海）来检测细胞增殖情况，步骤均严格按说明书操作。染色完成后，立即在荧光显微镜下进行观测并拍照。

1.7 Western blot检测使用适量含PMSF的RIPA裂解液（PMSF+RIPA 按1∶100 混合）裂解细胞并取出各组细胞提取细胞总蛋白，BCA 蛋白试剂盒（碧云天，中国江苏）定量检测蛋白质。等量蛋白用经8%、10%和12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶电泳分离，然后将蛋白转移至聚到偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，MA，USA）上。与一抗NLRP3（1∶1 000），Caspase-1（1∶1 000），PPAR-γ（1∶1 000），GSDMD（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）等，4 ℃过夜；洗涤后二抗室温孵育2 h，使用超敏ECL 化学发光试剂盒检测蛋白质条带，并使用Fusion 软件分析结果。

1.8 免疫组织化学（IHC）痤疮组织样本用福尔马林固定，石蜡包埋，切片成4 μm。切片与PPAR-γ一抗（1∶250）和二抗一起温育。在光学显微镜下观察结果。

1.9 统计学方法每种实验至少重复3次。所有计量数据使用表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析和q检验。采用GraphPad Software 8.0 进行统计学分析。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPAR-γ 在痤疮组织样本中表达明显降低采用IHC方法检测PPAR-γ在痤疮及正常皮肤组织中的表达水平，结果显示：PPAR-γ主要在表皮基底层和棘层表达；与正常皮肤组织相比，痤疮皮肤组织中PPAR-γ 表达明显下调，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）（图1）。

图1 PPAR-γ 在痤疮组织中表达下调Fig.1 PPAR-γ expression was decreased in acne

2.2 P.acnes 可诱导人角质形成细胞产生细胞焦亡效应ELISA 和Western blot 结果显示：IL-1β 和IL-18 水平显著升高，且呈时间-依赖方式升高（t=4.957，4.72；P＜ 0.01）。与对照组相比，P.acnes明显促进了焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1 和GSDMD表达。这表明P.acnes可诱导人角质形成细胞产生细胞焦亡，表现为胞内IL-1β 和IL-18，及细胞焦亡相关蛋白表达水平升高。

2.3 PPAR-γ 过表达细胞系检测本研究使用慢病毒LV-PPARγ 转染HaCaT 细胞过表达PPAR-γ，并采用Western blot 验证了过表达效率，见图3。

2.4 过表达PPAR-γ可抑制P.acnes诱导的细胞焦亡相关炎症因子水平ELISA 检测结果表明，对比未处理组，P.acnes组与LV-PPARγ-NC 组细胞均产生高水平的IL-1β和IL-18（t=5.26，7.23；P＜ 0.05）。然而，与P.acnes组和P.acnes+LV-PPARγ 组对比，P.acnes+ LV-PPARγ 组PPAR-γ 表达明显上调并且使IL-1β和IL-18水平明显减少。提示，上调PPAR-γ可抑制P.acnes诱导的炎症因子水平，保护角质形成细胞免受细胞焦亡损伤。

图2 体外人角质形成细胞中P.acnes 诱导的细胞焦亡Fig.2 P.acnes induced cell pyroptosis in human keratinocytes vitro

图3 PPAR-γ 蛋白表达水平检测结果Fig.3 Detection Results of PPAR-γ Protein Expression Level

图4 过表达PPAR-γ 抑制P.acnes 诱导的人角质形成细胞焦亡相关炎症因子水平Fig.4 The upregulation of the PPAR-γ inhibited P.acnes-induced pyroptotic-related inflammatory factors in human keratinocytes

2.5 过表达PPAR-γ 可抑制P.acnes 诱导的细胞焦亡相关蛋白的表达HaCaT转染LV-PPARγ过表达PPAR-γ，Western blot 检测发现，P.acnes明显降低了PPARγ 蛋白水平，促进了Caspase-1；GSDMD表达，见图5。在相同条件下，P.acnes+ LV-PPARγ组与P.acnes组比较，NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的蛋白质水平（t=6.27，6.43，7.15；P＜ 0.05）均明显减低。综上，上调人角质形成细胞中PPAR-γ 表达可降低P.acnes诱导细胞焦亡相关基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的表达水平。

图5 Western blot 检测P.acnes 诱导条件下过表达PPAR-γ HaCaT 后人角质形成细胞焦亡相关蛋白的变化Fig.5 The changes of pyroptotic-related proteins of human keratinocytes with PPAR-γ upregulation under P.acnes treatment detected by Western blot

2.6 过表达PPAR-γ可促进P.acnes诱导条件下人角质形成细胞的增殖能力EdU结果显示：P.acnes组HaCaT 细胞的增殖能力明显降低；与P.acnes组对比，P.acnes+ LV-PPARγ 组中检测到较高的细胞增殖水平，见图6。提示，上调PPAR-γ 可促进P.acnes诱导条件下人角质形成细胞的增殖。

图6 P.acnes 诱导条件下过表达PPAR-γ 后对HaCaT 细胞增殖能力的影响Fig.6 Effect of PPAR-γ upregulation on proliferation of HaCaT cells under P.acnes treatment

2.7 过表达PPAR-γ 可抑制P.acnes 诱导的细胞凋亡EdU 结果显示：P.acnes组HaCaT 细胞凋亡明显增加；与P.acnes组对比，P.acnes+ LV-PPARγ组中检测到较少的细胞发生凋亡，见图7。提示，上调PPAR-γ 可抑制P.acnes诱导下人角质形成细胞的凋亡。

图7 P.acnes 诱导下过表达PPAR-γ 后对HaCaT 细胞凋亡的影响Fig.7 Effect of PPAR-γ upregulation on the apoptosis of HaCaT cells under P.acnes treatment

3 讨论

痤疮作为一种常见的累及毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性疾病。炎症在AV的发病进程中起重要作用，其中，皮肤角质形成细胞（skin keratinocytes）可通过产生异常炎症反应，参与AV 的进展［15］。为探究P.acnes在人角质形成细胞中引起的细胞焦亡效应，本研究使用1×107CFU/mLP.acnes诱导HaCaT 细胞，结果发现：在HaCaT 细胞中，经P.acnes处理后可显著刺激IL-1β 和IL-18 生成；且IL-1β 和IL-18 生成呈时间依赖性模式，同时促进了NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 的表达。这表明P.acnes可以诱导细胞焦亡。有研究发现，P.acnes通过诱导人关节炎细胞中NLRP3/Caspase-1 通路产生过量的炎症因子，在对抗细胞焦亡方面的能力下降［16］。TANG 等［17］发现，P.acnes可通过刺激NLRP3/Caspase-1 细胞焦亡信号通路，可诱导髓核细胞表达NLRP3、IL-1β、caspase-1 和GSDMD 增加，并呈时间和剂量依赖的方式，对IL-1β 和IL-18 的过度表达有明显的上调作用。这均证明：P.acnes能诱导细胞焦亡。在机制方面，既往研究报道：细胞焦亡过程依赖于Caspase-1，在外界条件的刺激下，Caspase-1 和 NLRP3 可以成为一种聚合物复合物，即炎性小体，也称为 Caspase-1 依赖性炎性体。当Caspase-1被激活时，一方面可通过切割GSDMD，进一步诱导细胞膜穿孔、破裂，释放炎症因子，引起炎症反应；另一方面，IL-1β 和IL-18 的前体被切割，形成具有活性的IL-1β 和IL-18 分泌到胞外，募集更多的炎症细胞，从而扩大炎症反应［18］。同时，在NLRP3 的靶基因中，Caspase-1 是一个主要效应蛋白酶，能够介导细胞膜离子梯度发生改变，导致细胞膜破裂，释放炎性因子IL-1β 和IL-18，诱导细胞死亡［19］。上述研究表明，通过细胞焦亡进一步扩大炎症反应，可加重细胞损伤，导致细胞破坏。因此，P.acnes在人角质形成细胞中可通过诱导细胞焦亡效应，参与痤疮角质形成细胞破坏的过程。

既往有研究报道［20］，过表达PPAR-γ，可阻断Wnt/β-catenin 通路，改善大鼠的NP 和神经炎症。为了进一步探索PPAR-γ 是否参与痤疮疾病发展及发挥的作用，本研究发现：PPAR-γ 在AV 中表达下调，且过表达PPAR-γ 可以降低与细胞焦亡相关的炎症因子IL-1β 和IL-18 表达水平，NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的表达也减少。既往有研究报道［21］，肝细胞可通过激活PPAR-γ，减少乳酸脱氢酶（LDH）、IL-1β和IL-18的释放，抑制Caspase-1、GSDMD 的激活和NLRP3 的NOD 样受体的表达，来发挥保护肝细胞的作用。因此，PPAR-γ 在痤疮中，也可能是通过减少焦亡相关炎症因子IL-1β 和IL-18的释放，抑制焦亡相关基因Caspase-1、GSDMD和NLRP3，来降低痤疮的炎症反应。在抗细胞焦亡的机制研究中，以往研究［12］也报道PPAR-γ 可通过ROS/TXNIP/NLRP3 通路发挥对肝细胞的抗细胞焦亡保护作用。文献报道，发育期大鼠海马神经元中miR-223［22］及糖尿病肾病lncRNA H19［23］过表达均可能通过抑制NLRP3/Caspase-1 通路来减轻相应细胞的焦亡，从而减轻细胞炎症损伤。进一步说明，PPAR-γ 通过抑制NLRP3/Caspase-1 通路可减轻细胞焦亡。

在本研究中还发现，P.acnes诱导的HaCaT 细胞过表达PPAR-γ，人角质形成细胞增殖能力增加，细胞凋亡受到抑制。相关研究已证明［24］，通过激活PPAR-γ/RXR-α/Wnt 信号可促进滋养细胞的增殖、迁移和入侵。在心肌及软骨中激活PPAR-γ可抑制细胞的炎症，保护细胞免受凋亡［25-26］。因此，在P.acnes诱导的HaCaT 细胞中过表达PPAR-γ，可促进人角质形成细胞增殖，减少细胞凋亡。

综上所述，本研究证明P.acnes可诱导人角质形成细胞产生细胞焦亡，过表达PPAR-γ 逆转P.acnes诱导的角质形成细胞焦亡和凋亡，促进细胞增殖，可能与PPAR-γ 介导的细胞焦亡相关基因，如NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 等的表达发生改变相关。这有助于对痤疮炎症发生及调节机制的理解，且使用任何方法激活PPAR-γ 通路或细胞焦亡相关基因可能是减轻痤疮患者角质形成细胞炎症损伤的有效策略。PPAR-γ 介导的细胞焦亡在痤疮的发病机制中的研究是本文创新之处。由于本研究目前仅在体外利用HaCaT 细胞系进行研究，有必要进行动物体内的研究，以确定本研究的发现与正常角质形成细胞进行比较。

【Author contributions】CHEN Yan performed the experiments and wrote the article.YI Sha，ZHANG Yuting，HU Nan，LI Yue and YANG Lin performed the experiments.YI Sha revised the article.CHEN Yan and ZHONG Guishu designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.