氢气抑制TL1A/DR3通路对兔肢体缺血-再灌注后心肌细胞凋亡的影响

李林 殷月 王晨晨 庄宝祥 王岱君

潍坊医学院基础医学院 1解剖学教研室，2生理学教研室，3形态学实验室（山东潍坊 261053）

肢体缺血-再灌注损伤是临床中常见的一种病理生理过程，严重的肢体缺血-再灌注不仅影响局部缺血组织的存活和功能，还可造成全身炎症反应综合征和导致多器官功能受损［1-3］，其中心［4-5］便常发生此类损伤。肢体缺血-再灌注引起其他器官损伤的机制复杂多样，而细胞凋亡则是重要原因之一［6-7］。细胞凋亡是被精确调控的程序性死亡，主要通过三大信号传导通路调控，即死亡受体通路，线粒体通路和内质网通路［8］。其中，死亡受体通路则通过激活肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族中的死亡受体（death receptor，DR）而触发细胞凋亡。DR3 作为TNFR 超家族受体之一，其胞外结构域与配体TL1A 结合后可通过死亡结构域（death domain，DD）相互作用，引导TRADD-DD（tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein）募集到DR3-DD，建立近端膜平台招募下游受体，随后TRADD 与DR3 分离，TRADD 与招募到的FADD（fas-associated death domain protein）与Caspase8 结合，形成二级死亡诱导信号复合物，最终导致Caspase 依赖性凋亡［9-10］。至今，对肢体缺血-再灌注后心损伤及细胞凋亡并无十分有效的防治方法，探寻有效防治方法尤为重要。氢是自然界最简单的元素，氢气一直被认为属于生理性惰性气体，在生物体内不具有重要作用。直至2007年，OHSAWA 等［11］报道氢气可选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子以保护脑缺血-再灌注损伤后，才引起了研究氢气治疗疾病的热潮。研究表明，氢气在防治心缺血-再灌注中也表现出不俗的潜力［12-13］。笔者在前期工作中发现，氢气可抑制DR4 和DR5 的配体TRAIL（tumor necrosis factorassociated apoptosis induced ligand）表达，从而减轻骨骼肌细胞凋亡［14-15］。而氢气对同为死亡受体的DR3 以及对肢体缺血-再灌注后心肌细胞凋亡的影响却鲜有文献报道。本研究先采用KEGG 通路富集分析心肌缺血-再灌注后基因表达是否与细胞凋亡相关，为研究提供支持。TUNEL 观察肢体缺血-再灌注后心肌细胞凋亡情况，ELISA 测定血清TL1A 和DR3 水平，WB 法测定心肌组织TL1A 和DR3 蛋白相对表达量，RT-qPCR 测定心肌组织TL1A 和DR3 mRNA 相对表达量，以探讨氢气能否通过抑制TL1A/DR3 通路减轻肢体缺血-再灌注后心肌细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物雄性新西兰大耳白兔18只，兔龄70～80 d，体质量（2.08 ± 0.19）kg，按SPF 级动物饲养要求喂养，饲养环境设置为湿度（50 ± 10）%，温度（23 ± 2）℃，普通饲料喂养，自由饮水。实验动物由青岛康大生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）20160002。本实验由潍坊医学院实验动物伦理委员会批准，批准号：2021SDL281。

1.1.2 主要仪器与试剂主要仪器：CX41 光学显微镜，Olympus IX 73 荧光倒置显微镜及其摄像系统均由日本Olmpus 公司生产，DNM-9602 酶标分析仪由北京普朗新技术有限公司生产，AmershamImageQuant 800 超灵敏多功能成像仪由云南莱博科技有限公生产，QuantStudio™ 5 实时荧光定量PCR系统由赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产。

主要试剂：TL1A ELISA 检测试剂盒（JL52648-96T）购于上海江莱生物科技有限公司，DR3 ELISA 检测试剂盒（MM-8276402）购于江苏酶免实业有限公司，一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（C1088）购于碧云天生物技术研究所，DR3 抗体（A14261）购于Abclone，Caspase3 抗体（bs-0081R）、TL1A 抗体（bs-5092R）与ß-tubulin 抗体（bs-4511R）均购于北京博奥森生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）与BCA 蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术研究所，ReverTra Ace qPCR RT Kit 购于日本TOYOBO 公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血-再灌注数据集KEGG 通路富集从GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载GSE160516 数据集表达矩阵文件和GPL23038 平台文件。该数据集包括4 例假手术小鼠样本数据（GSM4874400-03）以及12 例心肌缺血-再灌注小鼠的样本（GSM4874404-15）数据。在RStudio 4.2.0 中通过“limma”包［15］对数据进行标准化。通过|log2FC| ＞ 1（Fold Change，差异倍数）和P＜ 0.05 过滤差异表达基因。最后，在rstudio 中使用“clusterprofiler”包［16］，设置P＜ 0.05，进行表达差异基因的KEGG 通路富集。

1.2.2 动物分组采用随机数字表法将18 只实验动物随机分为C 组、R 组和H 组，每组6 只。

1.2.3 缺血-再灌注模型建立C 组：200 g/L 乌拉坦5 mL/kg 耳缘静脉注射麻醉，将宽度为3 cm 的特制袖带连接台式水银血压计，绑缚于实验动物双后肢根部股动脉搏动处，不做充气加压处理［17］；R 组：在C 组处理的基础上，将袖带充气，以超过收缩压20～30 mmHg作为完全阻断血流的压力，保持此缺血状态4 h，然后袖带放气，使血流再通，形成双后肢缺血-再灌注模型，随即于兔右下腹处，以5 mL/kg 量的空气进行腹腔注射；H 组：以5 mL/kg用量行氢气腹腔注射，其余处理与R组相同。

1.2.4 取材于再灌注24 h 时，耳缘静脉取血液4 mL，静置25 min，2 500 r/min 离心10 min，取上清，-80 ℃冰箱分装冻存备用；立刻处死动物，摘取心脏，切取心脏左心室组织，用预冷生理盐水洗净后分为两部分，一部分放入4%多聚甲醛中固定，一部分放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.5 ELISA 检测兔血清TL1A，DR3 水平取-80 ℃冰箱冻存的血清，ELISA 法检测血清TL1A和DR3 水平，严格按照剂盒说明书操作。

1.2.6 TUNEL检测兔心肌细胞凋亡率心肌组织经4%多聚甲醛固定，丙酮脱水、二甲苯透明，常规制作石蜡切片（4 μm）。严格按照TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒要求操作。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗，滴加DAPI、PBS 冲洗、抗荧光淬灭封片液封片，Olympus IX 73 荧光倒置显微镜下观察。TUNEL 激发波长为450 nm（绿色荧光），DAPI 激发波长为400 nm（蓝色荧光）。每组（n=6）随机选取6 张切片，每张切片随机选取6 个视野取平均值（400×），用Image J 软件对TUNEL和DAPI 细胞进行量化，计算细胞凋亡率［TUNEL细胞数/（DAPI 细胞数+TUNEL 细胞数）］。

1.2.7 Western blot检测兔心肌组织TL1A、DR3及Caspase3 蛋白表达取0.05 g 冻存心肌组织液氮研磨，置于EP 管，加入强组织裂解液，离心，取上清，用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，计算所需蛋白上样量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，脱脂牛奶封闭（浓度8%），加一抗（Tublin 1∶40 000，TL1A 1∶3 500，DR3 1∶500，Caspase3 1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜，加入含二抗（山羊抗兔1∶2 000），室温孵育1 h，洗膜，Amersham Image Quant 800 超灵敏多功能成像仪显影，使用PS 截取图像和Image J 测定灰度值。

1.2.8 RT-qPCR 检测心肌组织TL1A、DR3 与Caspase3 mRNA 表达将C、R 和H 组的心肌组织由Trizol 法提取总RNA，总RNA 按试剂盒操作逆转录为cDNA，进行RT-qPCR 扩增，2-△△Ct计算相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 统计学分析采用GraphPad prism 9.0.0 对实验数据进行统计分析，统计方法采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey 法，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KEGG 通路富集结果通过对GSE160516 数据集差异基因的挑选以及KEGG 通路的富集，发现心肌缺血-再灌注后，基因表达富集在Apoptosis信号通路、TNF 信号通路和MAPK 信号通路等。见图1。

图1 GSE160516 差异基因的TOP20 KEGG 通路富集图Fig.1 The TOP20 KEGG pathway enrichment map of GSE160516 differential genes

2.2 兔血清TL1A 和DR3 水平与C 组比较，R 组兔血清TL1A和DR3表达水平显著增加（P＜ 0.01）；与R 组比较，H 组兔血清TL1A 和DR3，差异具有统计学意义表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜ 0.01）。见表2。

表2 兔血清TL1A 和DR3 水平Tab.2 TL1A and DR3 level of rabbits serum ±s，pg/mL

表2 兔血清TL1A 和DR3 水平Tab.2 TL1A and DR3 level of rabbits serum ±s，pg/mL

注：与R组比较，*P ＜ 0.01

组别C组R组H组F值P值DR3 10.085 ± 2.482*31.129 ± 3.957 12.495 ± 0.561*107.9＜ 0.001 TL1A 2.012 ± 0.354*8.317 ± 0.805 2.733 ± 0.105*273.3＜ 0.001

2.3 兔心肌细胞凋亡率TUNEL结果显示，R组与H 组心肌细胞发生了凋亡。相较于C 组［（1.191 ±0.168）%］，R 组［（5.465 ± 0.654）%］心肌细胞凋亡率显著升高（P＜ 0.01）；相较于R 组，H 组［（1.316 ±0.245）%］细胞凋亡率显著降低（P＜ 0.01）；H 组与C组比较，细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见图2。

图2 兔心肌细胞凋亡TUNEL 图（400×）Fig.2 TUNEL plot of apoptosis in rabbit myocardium（400×）

2.4 兔心肌组织TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相对表达量Western blot 结果显示，与C 组比较，R组兔心肌组织TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相对表达量显著增加，差异具有统计学意义（P＜ 0.01）；与R 组比较，H 组心肌组织中的TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相对表达量显著降低，差异具有统计学意义（P＜ 0.01）。见图3、表3。

图3 兔心肌组织TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白表达Fig.3 Expression of TL1A，DR3 and Caspase3 proteins in rabbit myocardium

表3 兔心肌组织TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相对表达Tab.3 Relative expression of TL1A，DR3 and Caspase3 proteins in rabbit myocardium±s，n =6

表3 兔心肌组织TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相对表达Tab.3 Relative expression of TL1A，DR3 and Caspase3 proteins in rabbit myocardium±s，n =6

注：与R组比较，*P ＜ 0.01

组别C组R组H组F值P值Caspase3 0.229 ± 0.011*1.432 ± 0.076 1.133 ± 0.010*1178＜ 0.001 TL1A 0.036 ± 0.010*0.481 ± 0.051 0.373 ± 0.010*346.2＜ 0.001 DR3 0.614 ± 0.034*0.756 ± 0.013 0.655 ± 0.035*37.70＜ 0.001

2.5 兔心肌组织TL1A、DR3和Caspase3 mRNA相对表达量与C组比较，R组兔心肌组织TL1A、DR3和Caspase3 mRNA相对表达量显著增加，差异具有统计学意义（P＜ 0.01），与R组比较，H组心肌组织TL1A、DR3 和Caspase3 mRNA 相对表达量显著降低，差异具有统计学意义（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。见表4。

表4 兔心肌组织TL1A、DR3 和Caspase3 mRNA 相对表达Tab.4 Relative expression of TL1A，DR3 and Caspase3 mRNA in rabbit myocardium ±s

表4 兔心肌组织TL1A、DR3 和Caspase3 mRNA 相对表达Tab.4 Relative expression of TL1A，DR3 and Caspase3 mRNA in rabbit myocardium ±s

注：与R组比较，*P ＜ 0.01

组别C组R组H组F值P值Caspase3 1.000 ± 0.121*2.530 ± 0.354 1.935 ± 0.381*37.55＜ 0.001 TL1A 1.000 ± 0.189*11.814 ± 1.235 6.954 ± 1.234*171.2＜ 0.001 DR3 1.000 ± 0.107*1.410 ± 0.088 1.158 ± 0.092*27.83＜ 0.001

3 讨论

心肌常发生缺血-再灌注损伤，包括心肌本身缺血-再灌注引起的损伤和其他器官或组织缺血-再灌注引起的损伤。心肌缺血-再灌注损伤机制复杂多样，心肌细胞凋亡为主要原因之一［18-19］。本研究中，对小鼠心肌缺血-再灌注数据集进行KEGG 通路富集，发现缺血-再灌注后心肌组织内细胞凋亡通路和TNF通路被激活，表明心肌缺血-再灌注后心肌细胞会触发由死亡受体通路调控的细胞凋亡［20］。有研究报道［21］，某些器官如肾等缺血-再灌注后可引起心肌细胞凋亡。虽然肢体缺血-再灌注后可引心肌损伤，但能否引起心肌细胞凋亡鲜有报道。

动物实验研究表明，心肌缺血-再灌注发生的细胞凋亡率大约为20%～30%［22-23］。另有临床研究表明［24］，急性心肌梗死血液再通后在梗死组织边缘区可观察到10%左右心肌细胞发生凋亡。本实验通过TUNEL 检测发现，肢体缺血4 h 再灌注24 h 后心肌细胞发生了凋亡，凋亡率为（5.464 5 ± 0.654）%。表明，肢体缺血-再灌注可引起心肌细胞凋亡，但此凋亡属继发性，凋亡率低于心肌原发者。Caspase3是细胞凋亡的关键执行蛋白之一［25］，激活后可裂解下游死亡底物，放大上游死亡级联，最终引起染色质凝结和DNA 断裂，导致细胞凋亡［26-27］。本研究检测了心肌组织内Casapse3 蛋白和mRNA 相对表达，发现R组与C组比较，Casapse3表达均显著升高（P＜ 0.01）。Casapse3 高表达进一步表明了肢体缺血-再灌注后心肌细胞发生凋亡。

氢气已在包括心肌缺血-再灌注［28］在内的许多系统疾病显示出治疗潜力，在众多的治疗机制中，抗细胞凋亡占有重要地位［29］。前期研究发现［14］，氢气可抑制TRAIL 激活，从而抑制细胞凋亡。DR3作为TNF 家族的死亡受体，与配体TL1A［36］结合后会触发由死亡受体通路调控的细胞凋亡［30］，且TL1A［31-32］和DR3除了膜结合的形式之外，也存在着可溶形式［33］。本实验通过ELISA 检测血清TL1A 和DR3 的表达，发现两者表达水平均显著升高（P＜0.01），表明当肢体缺血4 h 再灌注24 h 后血清内TL1A 和DR3 表达水平均上调。上调的TL1A 可与心肌细胞膜上的DR3 受体结合，触发死亡受体途径心肌细胞凋亡。而腹腔注射氢气后，血清TL1A和DR3 的表达水平显著下降（P＜ 0.01），甚至降至C组水平，提示氢气能有效抑制TL1A和DR3释放。

此外，本研究从蛋白和mRNA 水平检测了心肌组织内TL1A、DR3和Caspase3的相对表达水平。观察到，与C组比较，R组TL1A、DR3和Caspase3表达水平均有显著升高（P＜ 0.01），蛋白和mRNA 表达水平结果一致。此结果表明，心肌组织内有TL1A和DR3的表达且肢体缺血-再灌注可引起心肌组织内TL1A和DR3表达上调，上调的TL1A与DR3结合后可激活TL1A/DR3通路，上调Caspase3表达，最终导致心肌细胞凋亡。H 组与R 组比较，TL1A、DR3和Caspase3 在蛋白和mRNA 表达水平均显著降低（P＜ 0.05）。此结果表明，氢气可下调心肌组织内TL1A 与DR3 的表达及抑制心肌细胞释放TL1A，并竞争结合DR3 以阻断TL1A/DR3 通路向下传递信息，降低Caspase3表达，从而减少细胞凋亡。

本研究是以TL1A/DR3 通路为切入点探讨氢气对肢体缺血-再灌注介导心肌细胞凋亡的影响，表明氢气可抑制TL1A/DR3 通路以减轻此凋亡。但有关氢气作用于TL1A/DR3 的具体位点，不同氢气剂量、浓度等对防治效果的影响等尚不明确。肢体缺血-再灌注继发心肌细胞凋亡机理复杂，相互之间又有密切联系，对其防治尚有大量的工作需要开展。今后将继续加大、加深研究，以期为临床提供更多有价值的资料。

【Author contributions】LI Lin and YIN Yue performed the experiments and wrote the article.WANG Chenchen revised the article.ZHUANG Baoxiang performed the experiments and analysed the data.WANG Daijun designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.