他喹莫德对人胶质母细胞瘤细胞恶性表型的影响及相关机制

柳晓蕊 袁忠民 郅程 张媚媚 简晓顺 彭怀东

1广州医科大学附属肿瘤医院药学部（广州 510095）；广州医科大学附属第二医院2神经科学研究所，3病理科，4药学部（广州 510260）

胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，GBM 细胞有高度增殖、浸润性生长的生物学特性，手术难以全部切除，患者预后极差［1］。同时，由于血脑屏障的存在，大部分分子量大、脂溶性差的化疗药物难以到达病灶发挥药效，目前除替莫唑胺外临床上可用于治疗GBM 的药物极少［2］。而GBM 作为高级别胶质瘤，对替莫唑胺的耐药率也高达50%～75%［3］，因此临床迫切需要开发一些新的药物用于治疗GBM。近年来研究表明在GBM 内存在驱动肿瘤发生的胶质瘤干细胞（glioma stem cell，GSC）亚群，尽管该细胞亚群在GBM 中占比非常低，但是这些GSC 具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，被认为是导致GBM 进展、转移、复发、耐受放化疗的重要原因［4］。因此靶向抑制GSC 是治疗恶性GBM的重要策略，探索寻找对GBM 干细胞特性有抑制作用的药物也是抗GBM 药物研发领域的热点。

他喹莫德（Tasquinimod，Tasq）是由法国益普生（Ipsen）公司和瑞典活跃生物（Active Biotech）公司共同开发的用于治疗前列腺癌的小分子药物［5］。Ⅰ期和Ⅱ期临床试验结果显示Tasq 对前列腺癌具有很好的疗效和安全性［6］，目前尚未上市。已有的研究表明Tasq 是组蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）特异性的变构调节剂［7］，同时也是钙结合蛋白S100A9 蛋白的抑制剂［8］。Tasq能够作用于肿瘤微环境，具有克服肿瘤相关免疫抑制，抑制肿瘤生长、血管生成、转移的潜力［9］。本课题组前期研究发现，HDAC4 在人源GBM 组织中高表达并与肿瘤恶性程度相关，HDAC4 通过调控MKK7/JNK/c-Jun 信号传导通路促进GBM 细胞增殖、侵袭［10］。作为一种新型药物，推测Tasq 在治疗GBM方面具有巨大的潜力。为此，本研究通过体外培养U87、U251 和人源GSC 等探讨Tasq 对GBM细胞系增殖、迁移、EMT、干细胞特性等恶性表型的影响，为该药进一步开发应用于临床治疗GBM提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞GBM 细胞株U87、U251 购买于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；GSC 细胞株为苏州大学欧阳佳博士惠赠。

1.2 主要药品与试剂Tasq（纯度＞ 99%）购自Selleck 公司；DMEM 高糖培养基、胎牛血清（FBS）、Neurobasal 培养基、B27 添加剂、EGF、bFGF、青霉素-链霉素双抗购自美国Gibco 公司；DMSO、CCK-8试剂盒、多聚甲醛购自美国Sigma 公司；一步法TUNNEL 细胞凋亡检测试剂盒、免疫染色通透液（Triton X-100）、BCA蛋白检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；Transwell板购自美国CORNING公司；4'，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）购自Thermofisher公司；单克隆抗体Snail 购自Abcam 公司，Cleaved Caspase-3、BCL-2、Vimentin、SOX2、Nestin、Actin 等单克隆抗体购自Cell Signaling Technology 公司。

1.3 药物溶解25 mg Tasq 加入1.23 mL DMSO 制成50 mmol/L 的储备液。

1.4 细胞培养将U87 和U251 置于含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中培养；GSC置于含有20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、1%谷氨酰胺和2% B27 的Neurobasal 培养基中培养。培养环境均为5% CO2、37 ℃。

1.5 细胞活力测定取对数期生长的U87 和U251制成单细胞悬液，并以每孔4×103接种至96 孔板，培养过夜细胞贴壁后，分别加入含有Tasq 0、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L 的培养基，继续培养24 h 或48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育1 h 后用酶标仪检测波长为490 nm 处的吸光度并计算细胞存活率，每个浓度设置5 个副孔并重复3 次。

1.6 细胞凋亡染色将U87 和U251 以每孔2×104个接种于24 孔板中，贴壁后分别加入含有相应浓度药物的培养基继续培养48 h，PBS 洗涤1 次后用4%多聚甲醛固定30 min，接着用PBS 洗涤1 次，然后用PBS 稀释的0.3% Triton X-100 室温下孵育5 min，接着洗涤2 次，加入100 μL TUNEL 检测液在37 ℃下孵育60 min，最后用抗荧光淬灭封片剂封片，使用计算机成像系统从显微镜下随机选取5 个视野拍照（×200），计数并统计凋亡细胞占比，重复3 次。

1.7 细胞克隆实验将U87 和U251 以每孔500 个接种于6 cm 培养皿中，贴壁后分别加入含有相应浓度药物的培养基继续培养7 d，弃去培养基，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS 清洗2 次后用0.1%结晶紫染色20 min，然后拍照计数，重复3 次。

1.8 细胞Transwell 迁移实验将U87 和U251 以每孔1×105个接种于六孔板中，贴壁后分别加入含有相应浓度药物的培养基中培养48 h，收集每组细胞并计数。使用孔径为8 μm、24 孔的Transwell板，在Transwell 上室中，加入200 μL 含1% FBS 的DMEM 培养基，其中细胞密度为2×104个每孔，下室加入600 μL 含有20% FBS 的DMEM 培养基，24 h 后用乙醇固定30 min 后再用0.1%结晶紫染色20 min，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞，PBS 清洗2 次，随机选择5 个视野拍照（×100），计数并重复3 次。

1.9 细胞成球实验将GSC以每板3 000个接种于6 cm 超低附着培养板后，加入含有相应浓度药物的Neurobasal 培养基，培养5 d 后显微镜下随机选择5 个不同视野拍照（×100），对直径大于50 μm的微球进行计数，重复3 次。

1.10 免疫荧光染色将细胞成球实验的各组细胞分别接种于多聚赖氨酸包被的细胞爬片上。1 h后，用PBS冲洗3次，在室温下用含有0.3% Triton X-100 的山羊血清固定1 h。然后每个玻片滴加300 μL PBS 稀释的5% BSA 封闭30 min，滴加兔抗Sox2 一抗（1∶1 000）、兔抗Nestin 一抗（1∶1 000）稀释液在4 ℃下摇床孵育过夜。PBS 冲洗玻片后用荧光标记的二抗在室温下孵育2 h。样品漂洗1 次，用DAPI 染色10 min，再次洗涤以去除多余的DAPI 并风干。在共聚焦显微镜下对载玻片成像并计算平均荧光强度，重复3 次。

1.11 Western blot 实验U87 和U251 细胞以每孔1×105个接种于六孔板中，贴壁后加入含有相应浓度药物的培养基培养48 h，然后弃去培养基，用预冷的PBS 冲洗2 次后收集各组细胞。收集经含有相应浓度药物的培养基培养5 d 的GSC。对各组细胞加入细胞裂解液处理，超声和离心后使用BCA 试剂盒对样品进行蛋白浓度检测。使用10%的SDS-PAGE 凝胶电泳离蛋白样品2 h，然后用 PVDF 膜电转1.5 h，并在5%脱脂牛奶中封闭60 min。将封闭后的PVDF 膜放在相应的一抗（1∶1 000）中孵育过夜，水平摇床低速震荡1 h 后用TBST 洗涤3 次，再放入相应的二抗（1∶5 000）中摇床低速震荡1 h。二抗孵育完成后用TBST 洗涤3 次，使用ECL 检测系统曝光条带，实验重复3 次。

1.12 统计学方法使用SPSS 20.0 软件进行数据分析。重复实验的数据采用均数±标准差来表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜ 0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tasq 对U87、U251 细胞增殖的影响CCK-8法结果见图1，Tasq 作用于U87 和U251 细胞24 h后，相较于对照组（0.1% DMSO），10 μmol/L 的Tasq 即可以显著降低U87 和U251 的细胞存活率（P＜ 0.01），且浓度越高细胞存活率越低；48 h 的细胞存活率显著低于24 h（P＜ 0.01）。Tasq 对U87和U251 细胞增殖的抑制作用呈现显著的浓度依赖性及时间依赖性。Tasq 作用于U87 和U251 细胞48 h 的IC50分别为39.76、42.32 μmol/L。因此，参考相应的IC50值本研究选取Tasq 的浓度为0、20、40 μmol/L，作用时间为48 h进行后续实验。

图1 Tasq 抑制U87 和U251 细胞的增殖Fig.1 Tasq inhibited proliferation of U87 and U251 cells

2.2 Tasq 对U87、U251 细胞凋亡的影响TUNEL细胞凋亡染色结果显示，Tasq 可诱导U87 和U251细胞发生凋亡（图2A-B），且浓度越大，凋亡细胞占比越大，差异具有统计学意义（P＜ 0.01），见图2C。Western blot检测凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和抗凋亡蛋白BCL-2的表达，结果显示，Tasq可促进Cleaved Caspase-3表达，下调BCL-2的表达（图2D）。

2.3 Tasq 对U87、U251 细胞迁移的影响Transwell 迁移实验结果显示，与对照组比，随着Tasq 浓度的增加，U87和U251迁移到下室的细胞数量逐渐减少，差异有统计学意义（P＜ 0.01），见图3。结果表明，Tasq抑制U87和U251细胞的迁移能力。

2.4 Tasq 对U87、U251 集落形成的影响克隆形成实验结果显示，与对照组比，且随着Tasq 浓度的增加，U87 和U251 细胞形成的集落数量减少，差异有统计学意义（P＜ 0.01），见图4。结果表明，Tasq抑制U87和U251细胞集落形成的能力。

2.5 Tasq对U87、U251细胞EMT相关蛋白表达的影响Western blot 检测结果表明，0、20、40 μmol/L的Tasq处理U87和U251后，随着Tasq浓度的增加，EMT 相关蛋白Snail、Vimentin 的蛋白表达量依次下降，见图5。实验结果提示Tasq 能抑制U87 和U251 细胞的EMT。

2.6 Tasq 对GSC 成球能力的影响鉴于GSC 在GBM 进展和复发中的关键作用，通过球体形成实验评价Tasq 对GSC 成球能力的影响。结果显示，与对照组比，随着Tasq 浓度的增加，GSC 在悬浮培养基中形成球体的数量依次减少，差异有统计学意义（P＜ 0.01），见图6。结果表明，Tasq 抑制GSC的成球能力。

2.7 Tasq 对GSC 干细胞特性相关蛋白表达的影响 进一步探讨Tasq 对GSC 干细胞特性相关蛋白表达的影响，通过免疫荧光染色和Western blot 检测经Tasq 处理5 d 后GSC 中干细胞特性相关蛋白Sox2 和Nestin 表达的情况。免疫荧光染色实验结果表明，随着Tasq 浓度的增加，GSC 形成的球体中Sox2、Nestin 的原位表达减少，相对荧光强度显著下降，差异有统计学意义（P＜ 0.01），见图7A-B。Western blot 检测结果表明，随着Tasq 浓度的增加，GSC 中Sox2、Nestin 的蛋白表达量依次下降，见图7C。上述实验结果提示Tasq 抑制GSC 的干细胞特性。

3 讨论

在前列腺癌的研究中，Tasq 被认为是一种口服抗血管生成的药物。Tasq 可以显著上调前列腺癌组织中凝血栓蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）及其mRNA 的表达，高表达的TSP-1 可以抑制成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）的表达，同时TSP-1 作为缺氧诱导因子1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）的上游基因，通过抑制HIF-1α 负调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达［8］。FGF 和VEGF 是促进前列腺癌血管生成的关键因子［11］，Tasq 通过调控TSP-1 进而负调控VEGF 和FGF 的组织水平，阻断其在内皮细胞上的受体，将“血管生成开关”转化为抗血管生成状态，从而抑制新生血管形成和转移［11-12］。Tasq 还被认为通过特异性的与HDAC4 蛋白的锌指结构域结合，通过改变HADC4的整体构像调控HDAC4活性［7］，而HDAC-4/NCOR/HDAC-3 复合体是HIF-1α 去乙酰化所必需的，所以Tasq 通过调控HDAC4 阻止HIF-1α 的去乙酰化抑制VEGF 的转录［13］。总之，Tasq 通过作用于TSP-1 和HDAC4 两个关键的靶点，抑制HIF-1α及其下游基因进而抑制低氧诱导的血管生成。

图3 Tasq 抑制U87 和U251 细胞的迁移Fig.3 Tasq inhibited migration of U87 and U251 cells

Tasq 还可以作用于肿瘤微环境，其机制为Tasq 抑制肿瘤环境中髓源性抑制细胞（myeloidderived suppressor cell，MDSC）和肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）的浸润，并促进TAM 中抑制免疫反应并促进血管生成的M2表型向促进免疫反应并抑制血管生成的M1 表型转化［9，14］。在MDSC 中，在锌存在的条件下钙结合蛋白S100A9 与toll 样受体-4、晚期糖基化终产物受体结合，促进炎症反应；S100A9 还可以将炎症细胞和肿瘤细胞招募到转移位点。髓样细胞和肿瘤细胞表达的S100A9 促进MDSC 和TAM 的积累和激活［15］。而Tasq 是S100A9 抑制剂［16］，通过抑制S100A9 蛋白活性发挥抗炎和调节MDSC 的作用。基于Tasq 独特的抗血管生成和免疫调节的组合作用，该药单药或联合其他药物有望用于治疗临床各种实体肿瘤。

肿瘤细胞增殖与凋亡之间严重失衡，抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡是治疗肿瘤的重要策略。本研究发现Tasq 能够呈浓度依赖性和时间依赖性地抑制U87 和U251 增殖，抑制抗凋亡基因BCL-2 的表达并激活Cleaved Caspase-3 介导的细胞凋亡。本课题组前期研究也发现Tasq 通过调控HDAC4 活性进而调控HDAC4/KLF5/SP1 复合物介导MKK7/JNK/c-Jun 信号传导通路抑制GBM 细胞增殖，Tasq 通过JNK 信号通路参与调控GBM 细胞增殖、凋亡［10］。HDAC4 还可以通过增强CDK1 和CDK2 的表达，抑制p21 和p27 的表达来改善胶质瘤细胞的增殖和周期进程［17］。鉴于HDAC4 在调控胶质瘤细胞周期的重要作用和Tasq 特异性地与HDAC4 结合并抑制其乙酰化作用，推测Tasq 可能通过调控HDAC4 活性抑制U87 和U251 增殖并促进其凋亡，但是详细的机制尚不完全明确。

图4 Tasq 抑制U87 和U251 细胞的集落形成Fig.4 Tasq inhibited the colony forming ability of U87 and U251 cells

图5 Tasq 抑制U87 和U251 细胞EMT 相关蛋白（Snail、Vimentin）的表达Fig.5 Tasq inhibited the expression of EMT-related proteins（Snail、Vimentin）in U87 and U251 cells

GBM 呈浸润性生长的特性主要是因为肿瘤细胞获得了向周边脑组织高迁移和侵袭的能力所致，而EMT 是GBM 细胞获得这一特性的关键机制［18-19］。本研究发现Tasq 能够抑制U87 和U251 的迁移，并抑制EMT 相关基因Snail 和Vimentin 的表达。Tasq 对Snail 和Vimentin 表达的调控机制尚不明确。有研究表明，HDAC4 能够激活气道上皮细胞的EMT，下调HDAC4 表达可减少气道上皮细胞发生EMT［20］；过表达HDAC4 增强了U251 细胞中Vimentin、β-catenin 和E-cadherin 等EMT 标记物的表达［17］。在鼻咽癌细胞中Tasq 通过抑制HDAC4抑制其EMT［21］。因此，Tasq 可能通过调控HDAC4抑制U87 和U251 细胞迁移及EMT，但是具体作用机制有待进一步研究。

图6 Tasq 抑制GSC 的球体形成Fig.6 Tasq inhibited sphere formation of GSC

图7 Tasq 抑制GSC 干细胞特性相关蛋白（Sox2、Nestin）的表达Fig.7 Tasq inhibited the expression of stem cell-related proteins（Sox2、Nestin）in GSC

尽管GBM 具有高度异质性［22］，在GBM 中存在一群类似干细胞样的肿瘤干细胞，被称为胶质母细胞瘤干细胞，GSC 与肿瘤发生、持续生长和复发密切关联［23］。鉴于GSC 在GBM 进展中的重要作用，本研究探讨了Tasq 对GSC 干细胞特性的影响，本研究发现Tasq 能够显著抑制GSC 球体形成能力、抑制干细胞相关基因SOX2 和Nestin 的表达。从单一肿瘤细胞形成完整克隆是肿瘤细胞具有干细胞特征的重要表现，本研究发现Tasq 能够显著抑制U87 和U251 集落形成。上述结果表明Tasq可以在体外抑制GBM 细胞系的干细胞特性特征。

综上所述，本研究发现Tasq 可在体外抑制GBM 细胞增殖、迁移、集落形成和EMT，并促进其凋亡；Tasq 抑制GSC 成球能力和干细胞特性相关蛋白的表达。基于课题组前期的研究结果和在前列腺癌中已被证实的研究结果，我们认为Tasq产生上述作用的机制与其特异性地作用于HDAC4、多途径抑制血管生成的多个关键靶基因和调控肿瘤微环境有关，Tasq 通过抑制GBM 细胞增殖、迁移、EMT、干细胞特性等恶性表型抑制其恶性进展。下一步，将通过裸鼠皮下成瘤或直接颅内成瘤实验探讨该药在体内对GBM 的效果并探讨体内作用机制是否与体外作用机制一致，以期进一步为开发Tasq作为抗GBM治疗药物提供研究基础。

【Author contributions】LIU Xiaorui performed the experiments and wrote original draft.YUAN Zhongmin provided resources.ZHI Cheng and ZHANG Meimei collected data and validated.JIAN Xiaoshun conducted supervision.PENG Huaidong designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.