XRCC6基因多态性与术后化疗胃癌患者预后的关系▲

陈 媛 李大鹏 成伟丽

(秦皇岛市第四医院胃肠肿瘤科,河北省秦皇岛市 066000)

胃癌是临床常见的恶性肿瘤,因起病隐匿,早期无典型症状,多数胃癌患者确诊时病情已处于中晚期,手术治疗效果差,病死率高[1],故化疗在中晚期胃癌的治疗中意义重大。如肿瘤对化疗药物产生耐药,不仅影响治疗效果,还会延误病情[2]。因此,寻找能够客观、准确评估化疗效果的生物标记物,对胃癌患者的化疗效果及预后评估具有重要意义。

奥沙利铂和顺铂等铂类药物是治疗胃癌的常用药物,此类药物可通过铂-DNA加合物靶向DNA,引起DNA畸变而调控DNA修复。若DNA修复功能受损可引起DNA不稳定,导致DNA链断裂甚至细胞死亡,增加肿瘤的发生概率,但如果DNA修复能力过强,则会产生耐药[3]。因此,有效控制DNA修复基因的修复功能是保证化疗效果的重要前提。癌变细胞中X-射线修复交叉互补蛋白6(X-ray repair cross complementing 6,XRCC6)是人体重要的DNA修复酶,在肿瘤发生、发展中起到重要作用,但其在胃癌化疗效果中的研究报告较少[4]。基于此,本研究通过检测术后行奥沙利铂+替吉奥化疗方案治疗的胃癌患者XRCC6基因的基因型分布频率,分析XRCC6基因多态性与术后化疗胃癌患者预后的关系,旨在为个体性化疗方案的制订,改善患者的化疗效果及预后评估提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院2018年2—12月收治的99例胃癌患者作为研究对象,其中男性66例、女性33例,年龄28～83(55.32±3.26)岁。纳入标准:经术后病理检查确诊为胃癌;临床分期Ⅱ～Ⅲ期;年龄>18岁;均为在我院接受胃癌切除手术和术后化疗治疗的初治患者;临床资料完整;患者或家属知情且签署知情同意书。排除标准:合并其他恶性肿瘤者;合并先天性免疫疾病或全身血液疾病者;认知障碍或精神疾病者;随访期间非疾病死亡或失访的患者。本研究获得我院医学伦理委员会批准。

1.2 术后辅助化疗方案 奥沙利铂140 mg/m2(每周期第1天给药)溶入500 mL 5%葡萄糖溶液中,静脉滴注2～6 h;口服替吉奥胶囊40 mg/m2(每周期第1～14天给药),2次/d。每个治疗周期为21 d,共治疗4个周期。

1.3 XRCC6基因rs2267437位点基因型的检测方法 抽取患者入院时空腹外周静脉血约3 mL,置于抗凝管内,以10 000 r/min离心5 min,去除上清液,采用酚-氯仿法常规提取血清DNA。PCR扩增的上游引物序列为5′-CTTCAGACCACTCTCTTCTC-3′,下游引物序列为5′-TCACCTCACAGTAGTCGTTG-3′。PCR反应体系共25 μL,包括DNA模板2 μL、PCR Master Mix [天根生化科技(北京)有限公司]12.5 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、去离子水6.5 μL。反应条件为:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性1 min,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共40个循环。使用Xmn Ⅰ限制性内切酶[生工生物工程(上海)股份有限公司]将PCR产物进行酶切反应,酶切反应体系总计20 μL,包括PCR产物7 μL、RE 10×Buffer 2 μL、乙酰化牛血清白蛋白0.2 μL、XmnⅠ 0.5 μL、去离子10.3 μL。37 ℃水浴30 min后将酶切产物加入琼脂糖凝胶的负极加样孔中,加入DNA Marker [天根生化科技(北京)有限公司]进行标记,以0.5×TBE进行电泳,接通恒压恒流电泳仪,电压3～6 V,电流20 mA,电泳时间约30 min,用ZE-7型手提式紫外检测灯(上海宝山顾村电光仪器厂)观察电泳情况,根据凝胶电泳结果中目的基因片段出现的情况判断各等位基因和基因型的分布(见图1),电泳判定rs2267437位点C、G等位基因产物大小分别为225 bp和230 bp。采用反向测序法对PCR产物进行测序,验证XRCC6基因有CC、CG、GG 3种基因型和C、G两种等位基因,其中CC型为野生纯合型,CG型为突变杂合型,GG型为突变纯合型。

图1 酶切产物XRCC6基因rs2267437位点产物电泳图

1.4 临床病理资料的收集 收集患者的年龄、性别、吸烟情况(吸烟量为10支/d或吸烟1年以上为存在吸烟史)、饮酒情况(每月至少饮酒1次或饮酒半年以上为存在饮酒史)、肿瘤直径、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、肿瘤临床分期、远处转移情况、淋巴结转移情况等临床病理资料。

1.5 随访与分组 以电话、微信、门诊等方式进行随访,随访内容为化疗开始至化疗36个月后胃癌患者的生存情况。根据存活情况,将患者分为存活组56例和死亡组43例。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料以[n(%)]表示,组间比较采用χ2检验;采用COX回归模型分析胃癌患者预后的影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同预后胃癌患者临床病理特征的比较 两组患者的肿瘤直径、肿瘤临床分期、远处转移情况、淋巴结转移情况比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);其中,死亡组肿瘤直径>5 cm、肿瘤临床分期为Ⅲ期、发生淋巴结转移、存在远处转移的患者比例更高(均P<0.05)。见表1。

表1 不同预后胃癌患者临床病理特征的比较[n(%)]

2.2 不同预后胃癌患者XRCC6基因的基因型分布频率的比较 两组患者的XRCC6基因的基因型分布频率差异有统计学意义(χ2=11.468,P=0.003);其中,死亡组患者的XRCC6基因GG基因型、CG基因型的频率均低于存活组(均P<0.05)。见表2。

表2 不同预后胃癌患者XRCC6基因的基因型分布频率的比较[n(%)]

2.3 胃癌患者化疗后预后影响因素的多因素COX回归分析 以预后(1=死亡,0=存活)作为因变量,以肿瘤直径(1=≥5 cm,0=<5 cm)、肿瘤临床分期(1=Ⅲ期,0=Ⅱ期)、淋巴结转移(1=是,0=否)、远处转移(1=是,0=否)、XRCC6基因的基因型(设置哑变量)作为自变量进行多因素COX回归分析。结果显示,肿瘤临床分期为Ⅲ期、淋巴结转移、远处转移是术后化疗的胃癌患者预后不良的独立危险因素(均P<0.05),而XRCC6基因突变情况是术后化疗的胃癌患者预后不良的保护因素(P<0.05),见表3。

表3 多因素COX回归分析

3 讨 论

胃癌发病的分子机制尚不完全清楚,但癌基因突变被认为在肿瘤细胞侵袭、转移过程中发挥重要作用[5]。化疗是指药物作用于肿瘤细胞而引起相关蛋白结构和功能改变,来抑制、杀死肿瘤细胞,进而控制疾病进展,但发生化疗耐药将大大降低化疗的效果,严重影响患者预后[6]。修复酶的基因可通过单核苷酸多态性影响酶的结构和功能,进而导致个体出现化疗耐药[7],因此修复酶的结构和功能稳定是化疗敏感的重要基础。遗传信息主要存在于DNA两条脱氧核苷酸链中,双链断裂会破坏DNA完整性,进而导致DNA片段损伤[8]。核苷酸切除修复是双链断裂修复的重要途径,修复酶相关基因所编码的蛋白在修复双链断裂过程中具有重要的作用[9],因此,此类基因或可作为评估胃癌患者化疗敏感性及预后的重要参考依据。

本研究结果显示,术后化疗的胃癌患者的预后可能与肿瘤直径、肿瘤临床分期、远处转移情况、淋巴结转移情况、XRCC6基因突变有关(均P<0.05),多因素COX回归分析结果显示,经校正相关临床病理特征后,XRCC6基因突变情况是术后化疗的胃癌患者预后不良的保护因素(P<0.05),即携带XRCC6基因rs2267437位点CG/GG基因型的术后化疗的胃癌患者预后更好,提示XRCC6基因发生杂合突变或纯合突变更有利于术后化疗胃癌患者的预后。铂类药物主要是通过破坏DNA发挥细胞毒性,进而导致DNA功能损伤来发挥抗肿瘤作用[10]。DNA修复增强可降低化疗药物的杀伤作用,进而影响化疗效果,而DNA损伤后修复即是铂类药物发生耐药的主要机制之一[11]。DNA修复是核苷酸通过识别受损DNA并进行片段切除,然后形成新DNA的过程,Ku70蛋白是在此修复过程中发挥重要作用的酶[12]。如核苷酸剪切修复功能降低,肿瘤细胞的DNA损伤后修复则受到抑制,进而肿瘤细胞增殖受阻,此时患者获得较好的化疗效果[13]。XRCC6基因编码的Ku70蛋白可与Ku80结合以激活DNA蛋白激酶,开启修复过程,而XRCC6基因rs2267437位点基因突变可影响Ku70蛋白表达,导致DNA双链断裂、修复途径被抑制,进而导致DNA修复能力降低,抑制铂类药物化疗耐药发生,化疗患者可获得更好的预后[14]。此外,还有研究表明,XRCC6基因是调控双链断裂修复过程的重要分子,其发生突变后可通过影响核苷酸对DNA的修复作用,推测可能是XRCC6基因突变降低了核苷酸表达,进而影响了DNA修复功能,减少化疗耐药的发生,故患者预后更好[15]。 因此,携带XRCC6基因rs2267437位点CG/GG基因型的术后化疗的胃癌患者预后更好。

综上所述,XRCC6基因多态性与术后化疗的胃癌患者的预后密切相关,携带XRCC6基因 rs2267437位点CG/GG基因型的术后化疗的胃癌患者预后更好。临床上可通过检测XRCC6基因多态性,预测铂类药物化疗应答效果,进而为个性化化疗方案的制订提供参考依据。然而本研究结论还有待扩大样本进一步验证,同时XRCC6基因多态性在胃癌化疗耐药中的作用机制也尚待深入挖掘。