miR-195-5p靶向PAPPA对肺癌A549细胞增殖、迁移的影响及分子机制

杨华军 何仕琼 李小平 林江 杜飞 简悦

(1遵义市第一人民医院(遵义医科大学第三附属医院)呼吸与危重症医学科,贵州 遵义 563002;2兴义市人民医院(贵州医科大学附属兴义医院))

肺癌是起源于肺实质或气道的恶性肿瘤,是癌症死亡的首要原因〔1〕。因早期诊断困难,大多数患者出现疑似肺癌的症状或偶然发现胸部影像学异常而进行诊断性评估,确诊时已丧失最佳治疗机会,预后较差。肺癌转移是病情恶化的主要原因,但转移及扩散的分子机制尚不明确。研究表明,miRNA参与肿瘤的发生、发展及分化,在肿瘤的增殖和转移中发挥重要作用〔2〕。miR-195-5p在甲状腺癌中具有调节细胞增殖、凋亡和侵袭的作用〔3〕,在骨肉瘤中,环状RNA Circ001422通过miR-195-5p/成纤维细胞生长因子(FGF)2/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)轴导致病情恶化〔4〕。妊娠相关血清蛋白(PAPP)A与细胞生长、分化密切相关,并参与肿瘤形成。靶基因预测其可能是miR-195-5p的靶基因,但miR-195-5p与PAPPA在肺癌中的研究还未见报道,本研究探讨miR-195-5p靶向PAPPA对肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响及分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 人肺腺癌细胞A549、人支气管黏膜上皮细胞BEAS-2B(中国科学院上海细胞库);Lipo-fectamine 3000(美国Invitrogen公司);miR-NC、miR-195-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-195-5p(上海生工生物工程有限公司);si-NC、si-PAPPA(美国San-ta Cruz公司);对照质粒(pcDNA)、过表达质粒(pcDNA-PAPPA)、野生型(WT)及突变型(MUT)PAPPA基因3′UTR荧光素酶表达载体(上海汉恒生物科技有限公司);实时荧光量定-聚合酶链反应(qRT-PCR)、SYBR Green荧光染料试剂盒(大连TaKaRa公司);胎牛血清、RPMI1640培养基(泰思腾生物技术有限公司);CCK-8试剂盒、PAPPA抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG二抗、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.2细胞转染及分组 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基和F12培养基分别培养人肺腺癌A549细胞和人支气管黏膜上皮细胞BEAS-2B。将细胞按1×105个/孔接种24孔板,培养至融合度为50%时,更换为不含血清的培养基继续培养12 h后再进行转染。miR-NC组与miR-195-5p组通过Lipofectamine3000分别将miR-NC质粒和miR-195-5p mimics转染至A549细胞,转染6 h后更换为常规RPMI1640培养基,继续培养1、2、3、4 d,收集对数生长期细胞检测细胞增殖。si-NC组、si-PAPPA组分别转染si-NC质粒与si-PAPPA质粒至A549细胞,转染及处理方法同上。为证实miR-195-5p是靶向PAPPA调控A549细胞增殖及凋亡,将miR-195-5p mimics分别与pcDNA及pcDNA-PAPPA共同转染至A549细胞,检测PAPPA能否逆转miR-195-5p促进凋亡及抑制增殖的生物学作用,后续实验分为miR-195-5p+pcDNA组、miR-195-5p+pcDNA-PAPPA组,转染方法同上。

1.3总RNA提取 枪头、EP管均去酶处理,Trizol法提取各组细胞总RNA。取2 μl RNA样品于紫外分光光度计上测定纯度及浓度。

1.4qRT-PCR 用qRT-PCR试剂盒检测miRNA相对含量。按说明书步骤进行操作,用基因特异性RT引物(U6:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′;miR-195-5p:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACGCCAATAT-3′)及通用型逆转录引物oligo dT prime将500 ng总RNA逆转录成cDNA。DEPC水将反转录所得的cDNA稀释5倍,采用特异性引物(β-actin上游引物:5′-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3′,下游:5′-CTTCGCGG-GCG ACGAT-3′;PAPPA上游引物:5′-ACAAA-GACCCACGCTACTTTTT-3′,下游:5′-CATGAACTGCCC ATCATAGGTG-3′;miR-195-5p上游引物:5′-GATAGCAGCACAGAAATATTGGG-3′,下游:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′,下游:5′-AGAG-AAGATTAGCATGGCCCCTG-3′)进行PCR,20 μl体系(PCR条件:95 ℃热启动3 min,95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s,40个循环),每孔均设2个复孔,采用2-ΔΔCt分析各组miRNA相对含量。

1.5CCK-8检测细胞增殖活力 调整细胞浓度为1×104个/ml,以100 μl/孔接种于96孔板,空白孔加入100 μl完全培养基,每组设置3个复孔进行常规培养。分别在铺板后1、2、3、4 d取出培养板,吸出培养基,每孔加入含10% CCK-8试剂的完全培养基100 μl,置于培养箱中继续孵育2 h;再取出培养板在酶标仪450 nm波长处检测吸光度OD值。

1.6Transwell实验 用无血清培养液重悬各组细胞,基质胶平铺覆盖Transwell上室,取200 μl接种并培养24 h,弃去培养液,用4%多聚甲醛固定30 min,再加入结晶紫染色,漂洗干燥后用显微镜拍照并计数,即为侵袭细胞数。

1.7划痕实验 用标记笔在6孔板背后每隔0.5～1.0 cm划一道横线,从中间横穿过孔,每孔至少穿过5条线,在孔中加入约5×105个细胞,37 ℃、5%CO2培养箱培养,第2天用10 μl枪头比着直尺,与标记线垂直的方向划两条平行线。用磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞洗涤3次,吸出划下的细胞,再加入无血清培养基,放入37 ℃、5%CO2培养箱,分别在0、6、12、24 h倒置显微镜观察并拍照。

1.8Western印迹 收集各组细胞加入RIPA蛋白裂解液,提取细胞总蛋白并用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度,各组蛋白(样品量60 μg)进行凝胶电泳,再转膜封闭,90 min后加入PAPPA(1∶500)蛋白一抗,用Tis-HCl缓冲液(TBST)洗涤后再加入二抗(1∶1 000),室温孵育2 h,TBST缓冲液反复冲洗3次,每次10 min,然后显影,置于凝胶成像系统观察各条带并用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1miR-195-5p和PAPPA在肺癌A549细胞中的表达 miR-195-5p在肺癌A549细胞中的表达较BES-2B明显降低,而PAPPA在肺癌A549细胞中表达明显增高,PAPPA蛋白在肺癌A549细胞中的表达也明显增高(P<0.05)。见表1、图1。

图1 PAPPA蛋白在肺癌A549细胞中的表达

表1 miR-195-5p、PAPPA mRNA及蛋白相对表达量在肺癌A549细胞中的表达

2.2过表达miR-195-5p对A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响 miR-195-5p组24、48、72、96 h细胞增殖能力显著低于miR-NC组(P<0.05);miR-195-5p组A549细胞侵袭及迁移个数显著低于miR-NC组(P<0.05)。见图2、表2。

图2 过表达miR-195-5p对A549细胞侵袭及迁移的影响(结晶紫染色,×100)

表2 过表达miR-195-5p对A549细胞增殖侵袭、迁移的影响

2.3沉默PAPPA对A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响 沉默PAPPA后A549细胞增殖、侵袭、迁移能力均显著低于si-NC组(均P<0.05)。见表3。

表3 抑制PAPPA对A549细胞增殖、侵袭及迁移的影响

2.4miR-195-5p靶向调控PAPPA表达 通过targetscan网站预测,miR-195-5p在靶基因PAPPA的3′UTR第833-840、848-854个碱基序列上具有相应的结合位点(图3)。转染WT-PAPPA,再转染miR-195-5p mimics后A549细胞的荧光素酶活性(0.71±0.06)较miR-NC组(1.00±0.04)明显降低(t=6.96,P=0.002);转染MUT-PAPPA后再转染miR-195-5p mimics,A549细胞的荧光素酶活性(0.99±0.03)较miR-NC组(1.01±0.03)无明显变化(t=0.82,P=0.460)。miR-195-5p组A549细胞中PAPPA蛋白表达(0.42±0.05)较miR-NC组(1.02±0.04)明显降低(t=-16.32,P<0.05),转染anti-miR-195-5p后A549细胞中PAPPA蛋白表达(1.11±0.05)明显高于anti-NC组(0.99±0.04;t=-3.24,P=0.030)。见图4。

图3 PAPPA的3′UTR中含有与miR-195-5p互补的核苷酸序列

图4 各组PAPPA蛋白表达

2.5过表达PAPPA逆转了miR-195-5p对A549细胞的增殖、侵袭和迁移作用 miR-195-5p+pcDNA-PAPPA组A549细胞的增殖活性较miR-195-5p+pcDNA组明显增强(P<0.05),侵袭及迁移能力明显增加(P<0.05)。见表4。

表4 过表达PAPPA能逆转miR-195-5p对A549细胞增殖、侵袭及迁移的影响

3 讨 论

肺癌因发病率高、远处转移早,早期诊断困难,很多病例确诊时已经处于中晚期,导致临床治疗效果不理想,亟待寻找新的治疗方法。癌症扩散转移是病情恶化及预后不良的标志,也是治疗失败和临床死亡的首要原因。因此,肺癌转移的分子机制逐渐成为研究热点。研究表明,miRNA影响癌细胞的侵袭和转移,通过调控下游靶基因表达从而影响疾病转化〔5〕。本研究结果提示,miR-195-5p具有调控肺癌A549细胞生物学行为的作用,miR-195-5p表达水平降低可能是非小细胞肺癌的潜在危险因素,可作为肺癌预后判断的潜在生物标志物〔6〕。

A549细胞中PAPPA表达水平明显升高,通过RNA干扰技术降低PAPPA的表达来证实PAPPA的生物学作用,本研究结果说明,抑制PAPPA与过表达miR-195-5p对A549细胞增殖、侵袭及迁移的作用相似,miR-195-5p对PAPPA具有负向调控作用。PAPPA通过诱导肺癌细胞增殖、促进侵袭和迁移从而导致肺癌细胞倍增及远处转移。本研究结果进一步证实,miR-195-5p靶向调节PAPPA,抑制其表达。既往研究表明,PAPPA是一种新的间质分泌因子,PAPPA高表达与晚期肝癌密切相关,提示预后不良〔7〕,miR-599/PAPPA轴还能减弱氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移和侵袭〔8〕。与上述报道相似,本研究结果提示,PAPPA在肺癌中高表达,并具有促进A549细胞增殖、侵袭和迁移等生物学作用,而癌症转移与细胞增殖、侵袭及迁移密切相关〔9〕,是肿瘤预后较差的独立危险因素〔10〕。Targetscan软件预测结果暗示PAPPA与miR-195-5p存在调控关系和结合位点,本研究证实了在肺癌中miR-195-5p和PAPPA之间的调控关系。

综上,miR-195-5p在肺癌中表达下调,过表达miR-195-5p通过抑制PAPPA的表达从而抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。