膀胱癌类器官模型的研究进展

孙晓宇，张志宏综述，张昌文 审校

（天津医科大学第二医院泌尿外科，天津 300211）

膀胱癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，其中3/4为高复发率、预后较好的非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC），1/4为高转移率、预后较差的肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC）[1]。尽管如今基于肿瘤分子分型进行靶向治疗或者免疫治疗等方面取得了极大进步，但近30%的NMIBC 进展为MIBC，患者5 年总生存率（overall survival，OS）仅为50%[2]。这与膀胱癌的高度异质性、较高的复发转移率和耐药性有关。

随着精准医疗的不断发展，亟需建立更有针对性的个体化治疗体系，新兴的体外三维培养类器官模型应运而生。类器官是将胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）或成体干细胞（somatic stem cells，SSCs）经过体外培养基培养，干细胞通过自我组织形式形成多种细胞类型组成的三维器官型结构[3-5]。与传统的二维肿瘤细胞系及人源肿瘤异体移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）模型相比，类器官模型可以很好的保留肿瘤组织的异质性和更真实的肿瘤微环境，为肿瘤研究提供了良好的临床前模型[6]。本文重点介绍膀胱癌类器官模型的研究进展，讨论其不足以及对未来应用前景进行展望。

1 膀胱癌类器官模型的建立

自2009 年Sato 等[7]利用富含亮氨酸重复序列的G 蛋白耦联受体5（leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5）阳性的肠道干细胞在添加Wnt 通路激动剂R-spondin、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抑制剂Noggin、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等生长因子的基质胶培养基中培养出具有隐窝绒毛结构的肠道类器官后，类器官技术有了突破性的进展。胃[8]、汗腺[9]、大脑[10]、乳腺[11]等人源类器官逐步建立。近5 年基于膀胱癌类器官模型的研究也相继发表（表1）。除了人源性膀胱癌类器官外，PDX 类器官也已构建成功[12-19]。2018 年Lee 等[12]建立了22个膀胱癌类器官系组成的膀胱癌类器官生物样本库，并通过外显子及全基因组测序证实了膀胱癌类器官与原发肿瘤组织病理学特征、体细胞突变和DNA 拷贝数改变等特征保持高度一致。同时在一定程度上阐述了膀胱癌类器官自身的进化特点，为膀胱肿瘤异质性研究提供了参考。2019 年，Mullenders等[20]从53 例患者样本中培养成功133 个膀胱癌类器官，并发现成纤维细胞生长因子（FGF）7和FGF10 可以促进膀胱癌类器官的增殖，进而对培养基进行了优化。人类癌症模型组织（Human Cancer Models Initiative，HCMI） 建 立 了 类 器 官 生 物 库（https：//ocg.cancer.gov/programs/HCMI），可获取现有类器官的基因和临床信息。

表1 膀胱癌类器官模型的文献回顾

2 膀胱癌类器官模型的应用

2.1 肿瘤机制研究 Shen 等[27]利用膀胱癌类器官模型联合体外和体内实验探索了磷酸甘油酯脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）的生物学功能，并验证了PHGDH 可与聚结合蛋白2（poly（rC）-binding protein 2，PCPP2）相互作用，上调溶质载体家族7 成员11（recombinant solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）表达，促进膀胱癌的恶性进展。Wang 等[29]建立了CRISPR-Cas9 基因编辑的膀胱癌类器官模型用以研究膀胱肿瘤耐药问题，得出通过靶向组织蛋白酶H 进行分化是治疗化疗耐药性MIBC 的潜在治疗策略。Vlaar 等[18]借助膀胱癌类器官模型证明了异常芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR）信号转导是尿路上皮肿瘤发生的重要驱动因素。这些研究都为人们进一步理清膀胱癌发病和耐药等过程中关键基因的功能提供了重要线索。

2.2 抗肿瘤药物筛选 膀胱癌类器官模型具有高保真特性，是药物测试的极佳模型。Mullenders 等[20]用3 个膀胱癌类器官系暴露于6 种针对膀胱癌一线化疗药物中，验证了不同膀胱癌类器官其敏感化疗药物不同。Kita 等[14]同样验证了膀胱癌类器官的药物敏感性与PDX 平行，类器官模型在快速建立、低成本和技术可行性等方面显示出重要优势。

除了对化疗药物进行敏感性检测外，Neal 等[30]建立了一种气-液界面（air-liquid interface，ALI）培养类器官模型的方法来保留免疫细胞，可在7 d 内对免疫治疗药物的功能测试。证实了在膀胱癌类器官模型中模拟肿瘤免疫微环境和对免疫检查点抑制剂的反应是可行的。Yin 等[31]建立了一种包含免疫微环境的肿瘤样细胞簇模型，可在14 d 内完成抗肿瘤药物筛选。

2.3 生物打印 近几年3D 生物打印技术日益成熟，促进了膀胱癌类器官模型不断优化。Kim 等[22]利用3D 打印技术，组建了包含肌肉层、肿瘤相关成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞的膀胱组装体（assembloids）。通过该组装体验证了FOXA1-BMP-hedgehog 信号轴在肿瘤和基质之间控制肿瘤可塑性的重要作用。

Yoon 等[25]利用压电喷墨打印（piezoelectric inkjet printing，IJP）技术，将膀胱癌类器官解离成单个肿瘤细胞制备为生物墨水，通过喷墨打印将单个细胞精确地分配到微孔板中培养成类器官。验证了IJP 技术可以有效的对细胞进行分类，对肿瘤异质性研究具有重大意义。

2.4 微流控技术 Gheibi 等[32]使用75 μm 微流体装置可以在较长时间内维持BC 细胞，并成功验证了膀胱癌类器官模型的药物反应性和耐药性。罗升昌等[33]借助微流控技术构建支架系统，进行了肿瘤类器官的血管化及多细胞共培养模式的探索，为类器官模型的工程化提供了宝贵经验。2021 年，Serex等[34]将微流控技术和生物打印技术相结合，建立了一种能够实时调节细胞浓度的微流控打印头，打印出了标准化的膀胱癌类器官，获得了可靠和可重复的结果。

3 膀胱癌类器官模型的挑战

3.1 规范标准的培养体系 目前全球类器官模型研究团队大多采用从小鼠肉瘤中提取的基质胶作为类器官的三维培养基质，但其各组分却各有特点，且具有潜在的免疫原性。因此难以通过一个统一的评价体系去定性定量。

有多个研究报道了在肿瘤类器官模型的构建过程中，正常细胞的生长速度和数量超过了肿瘤细胞，在后续传代中肿瘤类器官甚至消失[35-37]。因此亟需高选择性的培养基，实现目标类器官的快速生长。

我国今年发布了《肿瘤类器官诊治平台的质量控制标准中国专家共识（2022 年版》[38]，《类器官药物敏感性检测指导肿瘤精准治疗临床应用专家共识（2022 年版）》[39]。两部共识初步制订了肿瘤类器官质量及药敏检测相关标准。不同疾病类器官模型有其特有的特点，目前尚未有专病类器官模型的相应规范。

3.2 血管化及共培养体系 尽管目前膀胱癌类器官在药物研发、药敏检测等领域显现出独特的优势，但缺乏维持肿瘤生长的血管系统、免疫细胞等是其很大的局限。目前已有多个共培养体系报道[6，40-41]，但仍不能完全模拟体内肿瘤微环境。除了血管系统，Carroll 等[42]探索通过类器官模型在体外模拟神经系统。目前多个领域专家在共同研发含多传感器的类器官芯片平台，努力将生物力学及体内微环境融入到集合类器官模型中。

4 膀胱癌类器官模型的展望

首先，膀胱癌类器官模型在肿瘤机制探索、新药研究等方面是一种绝佳的临床前模型。实验动物因其价格昂贵、转运困难及福利运动等多方面因素越来越受到制约，在未来类器官模型代替动物模型是一种趋势。2022 年9 月29 日，美国参议院通过了食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）现代化法案（FDA Modernization Act 2.0），允许药物研究在可行的条件下使用替代方法。类器官模型将为未来制药行业和临床试验提供更有力的支持。

其次，类器官技术发展日益成熟，建立更加准确、快速、高通量、自动化的类器官模型是大势所趋。目前高内涵成像分析系统和基于机器学习的图像分析[43]研究正在不断探索。类器官模型结合染色质开放性测序技术（assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing，ATACseq）[44]、染色体三维基因组学测序技术（Bridge Linker-Hi-C，BL-Hi-C）[45]、代谢组学和蛋白组学的多组学联合研究，是未来疾病机制研究的重要部分。

最后，类器官芯片为核心，结合3D 打印技术和高内涵成像分析系统实现高精度、一体化、集成化、自动化是类器官发展的未来趋势。在未来，膀胱癌类器官模型有可能完全替代目前的二维肿瘤细胞系及PDX 模型，成为广泛应用的临床前模型。