基于melusin/Akt通路探究调控GDF-15对急性心肌梗死模型大鼠的干预效果

邵明君 黄翠翠 王岩 高远

(1滕州市中心人民医院急诊科,山东 枣庄 277500;2枣庄科技职业学院)

急性心肌梗死(AMI)是指冠状动脉血管发生急性狭窄和闭塞,引起心肌细胞缺血缺氧及坏死,涉及多个生物学环节,一系列生物信号通路参与调节〔1,2〕。生长分化因子(GDF)-15作为转化生长因子(TGF)-β超家族中的一分子,对于缺血性心脏病有一定的保护作用,GDF-15能够修复缺血、再灌注损伤后的心肌〔3〕。且相继有临床研究指出,GDF-15能够作为多种心源性疾病的诊断及预后指标〔4〕。有研究发现,GDF-15具有调节脂质代谢、抑制内皮细胞凋亡、抑制炎症细胞浸润等作用〔5〕。然而,目前已有的临床和基础研究结果仅能证实GDF-15能够改善血管闭塞引起的心肌缺血,对AMI的干预效果尚未明确〔6〕。melusin是一种胞内肌特异性表达蛋白,是一种特殊的生物应力感受器,可能通过调节下游信号Akt的磷酸化等调节心脏功能,对于melusin/Akt通路在AMI中的基础研究较少〔7～9〕。基于此,本研究对AMI大鼠采用GDF-15进行干预,探究其临床指标及其与melusin/Akt通路的关系。

1 材料与方法

1.1材料 选取35只清洁级SD雄性大鼠,8～10周龄,平均(8.55±0.95)周龄,体质量180～220 g,平均体质量(190.00±19.00)g,购自上海杰思捷公司,动物编号:SYXK(沪)2017-0037,大鼠均常规饲养,自由饮食饮水,温度适宜,湿度在50%左右。

1.2AMI模型〔10〕制备 采用结扎左冠状动脉前降支的方法制作AMI大鼠模型。27只大鼠于造模前正常饲养2 w,术前禁食12 h。根据大鼠体质量给予一定剂量的10%水合氯醛进行麻醉。严格控制剂量,避免因剂量而致大鼠死亡。麻醉成功后,固定手术台,将心电图导联与大鼠连接,用去毛器在大鼠左胸部进行备皮、消毒,随后用手术刀在3～4肋间作一横切口,分离肋间肌肉,钝性开胸后,轻轻挤压右胸壁,暴露心脏,找出左前降支,在室间沟左心耳的下方2～3 cm处,对前降支进行穿针结扎,迅速将心脏放回胸腔,关闭胸腔,挤出胸腔内的气体,密切观察大鼠生命体征及心电图的变化,根据大鼠心电图的变化确认造模成功后将胸壁缝合。术后注射3 d青霉素预防感染。造模成功后,将大鼠放回笼子,注意保暖,密切观测大鼠的生命体征。造模成功标准:前降支结扎成功的大鼠,可见Ⅱ导联的ST段呈弓背向上抬高,持续30 min以上,可以确认造模成功;除此之外,结扎后的心肌颜色变为白色或发绀,以及心电图出现高耸的R、T波,也可以判定造模成功,共计成功24只大鼠。

1.3分组及干预 将大鼠随机分为上调GDF-15组、下调GDF-15组、模型组各8只,未进行建模的8只正常大鼠作为正常组,下调GDF-15组于造模前2 d尾静脉注射100 μl滴度为106～107的GDF-15siRNA慢病毒(GC10312K1605)进行干预。上调GDF-15组于造模前2 d尾静脉注射100 μl滴度为106～107的GDF-15cDNA慢病毒(GC10312K1606)。GDF-15 siRNA慢病及GDF-15 cDNA慢病毒均购自广州复能基因有限公司。模型组及正常组均给予同等体积的生理盐水进行干预。

1.4各组心功能检测 大鼠经30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉,采用MyLabTMSigma VET小动物彩色多普勒超声仪(上海玉研科学仪器有限公司)检测左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD),并计算左室短轴短缩率(LVFS)和左室射血分数(LVEF)。

1.5各组心肌酶指标检测 采用酶联免疫吸附试验检测血清肌酸磷酸激酶同工酶(CKMB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量,取大鼠腹腔静脉血1 ml,低温高速离心机离心,3 500 r/min离心10 min分离血清后,酶联免疫吸附试验试剂盒购自上海纪宁实业有限公司,货号:JN5236、JN19786,具体实验步骤参照试剂盒说明书进行操作。

1.6各组心肌组织观察 实验5 d后,处死大鼠,取出其心肌组织。将其在10%甲醛溶液中固定后,石蜡包埋切片脱蜡至水,将切片同染色架放入烧杯中,自来水冲洗。切片入苏木素染液3～5 min后,自来水洗,1%盐酸酒精溶液分化,水洗,稀碳酸锂水溶液蓝化30 s,水洗。切片经80%乙醇脱水,入伊红染色液染色10～30 s。调色及脱水,透明封片,镜检。

1.7荧光定量PCR检测心肌组织GDF-15表达水平 大鼠处死后均取梗死区同一部位左室前壁心肌约20 mg,提取RNA。酶标仪上检测RNA的浓度计纯度后,进行反转录。最后进行qPCR,每个样本重复3次。GDF-15正向引物:5'-AGTGAGTCCTTGT-GTCTCTAC-3',反向:5'-GCAGGCTGGTGATGAGTC-3′;反应条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。

1.8Western印迹检测melusin/Akt通路相关蛋白表达 100 mg心肌组织中加入500 μl细胞裂解液充分匀浆后置于冰上裂解30 min。3 500 r/min离心10 min,收集上清,加入5×十二烷基硫酸钠(SDS)加载缓冲液,100 ℃煮沸10 min。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)转膜。聚偏氟乙烯(PVDF)膜用5%脱脂牛奶室温封闭1 h,加入封闭液稀释的melusin(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)抗体,4 ℃孵育过夜。磷酸缓冲盐溶液(PBST)洗涤3次,加入标记的二抗,室温孵育1 h,PBST洗涤3次,电化学发光(ECL)显影。

1.9统计学处理 采用SPSS26.0软件进行齐性方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组GDF-15表达比较 如表1所示,与正常组比,上调GDF-15组、下调GDF-15组、模型组GDF-15表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,上调GDF-15组GDF-15表达显著升高,下调GDF-15组GDF-15表达显著降低。与下调GDF-15组相比,上调GDF-15组GDF-15表达显著升高(P<0.05)。

表1 各组GDF-15及心功能、心肌酶指标比较

2.2GDF-15对各组心功能指标的影响 如表1所示,与正常组比,上调GDF-15组、下调GDF-15组、模型组LVEDD、LVESD表达显著较高,LVFS、LVEF表达显著较低(P<0.05);与模型组相比,上调GDF-15组LVEDD、LVESD表达显著较低,LVFS、LVEF表达显著较高,下调GDF-15组LVEDD、LVESD表达显著较高,LVFS、LVEF表达显著较低(P<0.05)。与下调GDF-15组相比,上调GDF-15组LVEDD、LVESD表达显著较低,LVFS、LVEF表达显著较高(P<0.05)。

2.3GDF-15对各组心肌酶指标的影响 如表1所示,与正常组比,上调GDF-15组、下调GDF-15组、模型组CKMB、LDH表达显著较高(P<0.05);与模型组相比,上调GDF-15组CKMB、LDH表达显著较低,下调GDF-15组CKMB、LDH表达显著较高(P<0.05)。与下调GDF-15组相比,上调GDF-15组CKMB、LDH表达较低(P<0.05)。

2.4各组心肌组织观察 如图1所示,模型组心肌纤维组织损伤较严重,排列不紧密且较紊乱,细胞间隙较大,形状不规则。正常组心肌组织排列整齐、致密且清晰可见其结构,细胞间的间隙较小且均匀。上调GDF-15组心肌纤维排列较为正常,形状尚可,心肌组织呈现出点状坏死,下调GDF-15组心肌纤维组织严重损伤,排列松散、紊乱,细胞间的间隙增大,形状怪异,呈现弥漫性。

图1 各组心肌组织观察(HE染色,×400)

2.5GDF-15对AMI模型大鼠melusin/Akt信号通路相关蛋白的影响 如表2、图2所示,与正常组比,上调GDF-15组、下调GDF-15组、模型组melusin、Akt表达显著较低(P<0.05);与模型组相比,上调GDF-15组melusin、Akt表达显著较高,下调GDF-15组melusin、Akt表达显著较低(P<0.05)。与下调GDF-15组相比,上调GDF-15组melusin、Akt表达显著较高(P<0.05)。

图2 Western印迹检测各组melusin、Akt蛋白表达

表2 GDF-15对AMI模型大鼠melusin/Akt通路蛋白的影响

3 讨 论

GDF-15能够使心脏梗死区域血管化程度增加,改善心功能。推测可能是GDF-15抑制了血管内皮的凋亡,释放促血管生成因子使血管内皮增生,丰富缺血区血管化,有利于缺血区内环境得到改善、提供丰富的血液供应,对于重建功能、改善心功能等具有重要的意义〔11,12〕。卫兵艳等〔13〕研究显示,GDF-15能够促进AMI小鼠缺血心脏的血管新生,抑制梗死及胶原纤维沉积,对改善AMI的心功能有非常积极的作用。本研究显示,上调GDF-15其GDF-15表达较高。GDF-15的表达对于改善心肌缺血、心室重构及心力衰竭的预后具有正向作用,GDF-15浓度与冠脉侧支形成呈正相关。有实验证实,GDF-15能够促进心肌内皮细胞增殖及成管,说明GDF-15有血管新生的作用〔14〕。本研究显示,上调GDF-15可有效改善心功能各项指标,缓解心室舒张和收缩功能,说明上调GDF-15可改善心功能。

心肌梗死后,由于损伤心肌结构会导致心力衰竭、心室重构等并发症的发生,因此,早期判断心肌梗死病变极其重要〔15〕。有研究表明,心脏急性缺血时,心肌组织相关酶发生异常变化,其中LDH和CKMB为特异性最强的,因此LDH和CKMB可作为AMI特异性指标,由于组织缺血缺氧、室壁张力增加,继而引发心肌组织坏死。释放抗原性物质、黏附分子、补体、激肽等多种炎症介质,诱导炎性细胞趋化,聚集于梗死部位,并释放炎症因子〔15,16〕。本研究显示,上调GDF-15对LDH和CKMB表达可有效改善,促进恢复正常表达,GDF-15激活心脏成纤维细胞分泌细胞外基质成分,修复心肌损伤,抑制梗死区扩张,对心脏起保护作用,从而改善LDH和CKMB表达,降低炎症反应〔17〕。

作为富含半胱氨酸的整合素1相关蛋白,Melusin分子量是38 kD,在心肌组织和骨骼肌中表达,melusin敲除的小鼠心脏的发育和基本功能并未影响,但melusin过表达可诱导代偿性的心肌肥厚,维持了心功能,而melusin缺失促进转变心力衰竭。有研究证实,在主动脉缩窄的患者中心功能的降低与melusin/Akt通路的表达减少具有正相关的关系〔18〕。随着梗死范围扩展、变薄室壁、扩张心室、室增加壁张力,激活机械应力感受器整合素,整合素将信号传递给胞内分子,激活一系列下游通路。melusin的信号途径包括Akt蛋白等,这一途径在心肌肥厚中起重要作用。上调GDF-15对大鼠急性心肌梗死及梗死后心室重构具有保护作用,可改善melusin、Akt蛋白表达,增加血液供应,在抑制心室重构和缓解心肌纤维化过程中发挥重要作用〔19,20〕。本研究显示,上调GDF-15可上调melusin、Akt蛋白的表达,提示上调GDF-15改善AMI作用机制可能与melusin/Akt信号通路有关。

综上所述,GDF-15上调能改善AMI大鼠心功能及心肌酶,其作用机制可能与melusin/Akt信号通路有关,为临床AMI靶向治疗提供理论依据。