木犀草素调控CTBP1-AS2/miR-493-5p对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞损伤的影响

谈丽丽 魏雪梅 韩崇岭 陈平

(青海省第五人民医院眼科,青海 西宁 810000)

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)的主要微血管并发症之一,也是全球致盲的重要原因。研究表明,人视网膜血管内皮细胞(hRECs)功能障碍是DR发展的初始事件,持续高糖刺激可增加活性氧的产生,诱导氧化应激增强和炎症反应,损害血管屏障,导致hRECs损伤和凋亡〔1〕。因此,减轻hRECs损伤可能有助于临床治疗DR。木犀草素是一种在膳食植物、中草药广泛存在的天然黄酮类化合物,研究报道木犀草素预处理可激活内皮型一氧化氮合酶和抑制线粒体氧化应从而激减轻糖尿病早期大鼠心肌缺血再灌注损伤,减轻高糖诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡〔2,3〕。木犀草素通过核因子相关因子2激活抗氧化蛋白表达还可减轻高糖诱导的肾脏系膜细胞损伤,延缓糖尿病肾病进展〔4〕。此外,木犀草素通过上调miR-21表达保护PC-12细胞免受过氧化氢诱导的氧化损伤〔5〕。然而,木犀草素是否对DR中hRECs损伤具有保护作用尚不清楚。长链非编码RNA(lncRNA)是非编码RNA的重要成员,研究报道lncRNA通过染色质修饰、表观遗传调控、miRNA调控等机制参与DR中多种病理过程,是DR诊断或预后的生物标志物以和潜在的治疗靶点〔6〕。研究发现糖尿病肾病患者外周血及高糖诱导的人肾系膜细胞中lncRNA C-末端结合蛋白-1反义RNA2(CTBP1-AS2)表达下调,过表达CTBP1-AS2可抑制高糖诱导的人肾系膜细胞氧化应激、细胞外基质积累和炎症反应〔7〕。靶基因预测显示miR-493-5p是CTBP1-AS2的潜在靶点,既往研究证实抑制miR-493-5p表达可减轻高糖刺激诱导的成骨分化缺陷,缓解糖尿病小鼠的骨质疏松情况〔8〕。然而,CTBP1-AS2是否靶向miR-493-5p参与DR中hRECs损伤并不清楚。本研究采用高糖诱导hRECs建立细胞损伤模型〔9〕,通过分析木犀草素对DR中hRECs凋亡、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl相关X蛋白(Bax)表达及氧化应激标志物丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平的影响,旨在探讨木犀草素的潜在保护作用,并探讨其作用与CTBP1-AS2/miR-493-5p途径的关系。

1 材料与方法

1.1实验材料 hRECs购于美国模式培养物保藏所;木犀草素(含量94.4%,111520-202006)购于中国食品药品检定研究院;miRNA荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购于上海生工生物工程公司;PrimeScript逆转录试剂盒购于大连宝生生物公司;miRNA反转录PCR试剂盒购于广州锐博生物公司;SYBR Green PCR Master Mix、膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin-Ⅴ-FITC)凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝生物公司;MDA检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒购于北京百奥莱博生物公司;兔源Bcl-2多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗、兔源磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、兔源Bax单克隆抗体购自上海碧云天生物公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养、转染和实验分组 hRECs细胞接种含有10%胎牛血清的DMEM培养基(含5.5 mmol/L葡萄糖)在97%湿度、37 ℃、含5% CO2培养箱中培养。每周换液2次。当细胞汇合度为80%时进行胰酶消化和传代,选择第5代对数期hRECs用于实验。取2×105个hRECs接种6孔板,按照Lipofectamine2000使用说明将pcDNA-CTBP1-AS2、pcDNA、si-CTBP1-AS2分别转染hRECs,收集转染48 h时hRECs。

实验分组:正常糖(NG)组:用含5.5 mmol/L葡萄糖培养液处理48 h的hRECs;甘露醇组(MA):用含5.5 mmol/L葡萄糖和25.5 mmol/L甘露醇培养液处理48 h的hRECs;高糖组(HG)组:用含30 mmol/L葡萄糖培养液处理48 h的hRECs〔9〕;HG+木犀草素低剂量组、HG+木犀草素中剂量组、HG+木犀草素高剂量组:采用含30 mmol/L葡萄糖和7.5或15.0或30.0 μmmol/L木犀草素〔3〕处理48 h的hRECs;HG+pcDNA组、HG+ pcDNA-CTBP1-AS2组:采用含30 mmol/L葡萄糖处理转染pcDNA或pcDNA-CTBP1-AS2细胞48 h;HG+木犀草素+si-CTBP1-AS2组:采用含30 mmol/L葡萄糖和30.0 μmol/L木犀草素处理转染si-CTBP1-AS2细胞48 h。

1.2.2实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测CTBP1-AS2和miR-493-5p表达 用TRIzol试剂提取各组hRECs总RNA,按照PrimeScript逆转录试剂盒或miRNA反转录PCR试剂盒合成cDNA,采用SYBR Green PCR Master Mix或miRNA荧光定量PCR试剂盒检测CTBP1-AS2或miR-493-5p表达。2-△△Ct法计算CTBP1-AS2(内参为GAPDH)和miR-493-5p(内参为U6)相对表达量。引物序列如下:CTBP1-AS2上游5′-CACGTGTGGAGCCCTTGTAG-3′,下游5′-ACCAACCACATCGTCCCTTC-3′;GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;miR-493-5p上游5′-TTGTACATGGTAGGCTTTCATT-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′。

1.2.3流式细胞术检测hRECs凋亡率 胰蛋白酶处理各组hRECs,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞两次,用1×结合缓冲液调整为2×105个/ml的细胞悬液。向反应管内加入500 μl细胞悬液,依次加入Annexin-V-FITC、碘化丙啶各5 μl置于暗室内孵育细胞15 min。1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡比例。

1.2.4Western印迹检测Bax和Bcl-2蛋白表达 向各组hRECs中加入RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度合格后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。随后将分离的蛋白转移到聚偏氟乙烯膜,室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h。随后将膜与Bax、Bcl-2、GAPDH一抗溶液4 ℃孵育过夜。Tween-20-Tris缓冲盐水(TBST)洗膜3次,用对应的二抗溶液室温下孵育膜1 h。最后将膜置于塑料盒,滴加化学发光试剂置于黑暗环境下显影、定影。Image-Pro Plus6.0软件分析各条带灰度值,以目的蛋白和内参GAPDH灰度值比值表示对应蛋白表达量。

1.2.5试剂盒检测hRECs中MDA水平和SOD活性 收集各组hRECs至离心管,加入提取液超声破碎细胞,获得细胞上清液。按照试剂盒检测说明书分析各组hRECs中MDA水平和SOD活性。

1.2.6双荧光素酶报告实验 根据starbase预测到的CTBP1-AS2与miR-493-5p之间的结合位点,合成含有miR-493-5p结合位点的CTBP1-AS2野生型(WT)序列,同时合成不含miR-493-5p结合位点CTBP1-AS2突变型(MUT)序列,分别将上述序列克隆到荧光素酶报告质粒pGL3以构建WT重组荧光素酶报告载体WT-circ_0010729和WT重组荧光素酶报告载体MUT-circ_0010729。按照脂质体转染法将miR-493-5p mimics、miR-NC分别与上述报告质粒共转染hRECs,采用双荧光素酶活性检测试剂盒分析转染48 h后hRECs的相对荧光素酶活性。

1.3统计学分析 采用SPSS13.0软件进行t检验、方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1木犀草素对高糖诱导的hRECs凋亡的影响 与NG组比较,HG组hRECs中CTBP1-AS2表达量、Bcl-2蛋白表达量显著降低,miR-493-5p表达量、Bax蛋白表达量、细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与HG组比较,HG+木犀草素低剂量组、HG+木犀草素中剂量组、HG+木犀草素高剂量组hRECs中CTBP1-AS2表达量、Bcl-2蛋白表达量显著升高,miR-493-5p表达量、Bax蛋白表达量、细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。HG+木犀草素低剂量组、HG+木犀草素中剂量组、HG+木犀草素高剂量组3组间上述指标差异均有统计学意义。见图1、表1、图2。

表1 木犀草素对高糖诱导的hRECs凋亡及氧化应激的影响

图1 木犀草素对高糖诱导的hRECs凋亡的影响

1～6:NG组、MA组、HG组、HG+木犀草素低剂量组、HG+木犀草素中剂量组、HG+木犀草素高剂量组图2 Western印迹检测各组Bcl-2和Bax蛋白表达

2.2木犀草素对高糖诱导的hRECs氧化应激的影响 与NG组比较,MA组hRECs中SOD活性、MDA含量变化无统计学意义,这可排除高渗对hRECs氧化应激的影响。与NG组比较,HG组hRECs中SOD活性显著降低,MDA含量显著升高,差异有统计学意义(均P<0.05);与HG组比较,HG+木犀草素低剂量组、HG+木犀草素中剂量组、HG+木犀草素高剂量组hRECs中SOD活性显著升高,MDA含量显著降低,差异有统计学意义(均P<0.05)。HG+木犀草素低剂量组、HG+木犀草素中剂量组、HG+木犀草素高剂量组3组间上述指标差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.3过表达CTBP1-AS2对高糖诱导的hRECs凋亡及氧化应激的影响 与HG组、HG+pcDNA组比较,HG+pcDNA-CTBP1-AS2组hRECs中CTBP1-AS2表达量,Bcl-2蛋白表达量、SOD活性显著升高,miR-493-5p表达量、凋亡率、Bax蛋白表达量、MDA含量显著降低,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2、图3。

表2 CTBP1-AS2对高糖诱导的hRECs凋亡及氧化应激的影响

1～3:HG组、HG+pcDNA组、HG+pcDNA-CTBP1-AS2组

2.4CTBP1-AS2靶向miR-493-5p Starbase预测到miR-493-5p与CTBP1-AS2序列间存在特异结合靶点,见图4。荧光素酶活性实验结果显示,与转染miR-NC(1.00±0.09)比较,转染miR-493-5p mimics后hRECs中WT-CTBP1-AS2的相对荧光素酶活性明显下降,差异有统计学意义(0.41±0.05,P<0.01),而MUT-CTBP1-AS2的相对荧光素酶活性变化差异无统计学意义(0.98±0.07 vs 0.95±0.10,P>0.05)。

图4 CTBP1-AS2和miR-493-5p的互补序列

2.5抑制CTBP1-AS2逆转木犀草素对高糖诱导的hRECs凋亡的影响 与HG组比较,HG+木犀草素组hRECs中CTBP1-AS2表达量、Bcl-2蛋白表达量显著升高,凋亡率、Bax蛋白表达量、miR-493-5p表达量显著降低(均P<0.05);与HG+木犀草素组比较,HG+木犀草素+si-CTBP1-AS2组hRECs中CTBP1-AS2表达量、Bcl-2蛋白表达量显著降低,凋亡率、Bax蛋白表达量、miR-493-5p表达量显著升高(均P<0.05)。见图5、表3。

表3 抑制CTBP1-AS2对逆转木犀草素对高糖诱导的hRECs凋亡及氧化应激损伤的影响

1～2:HG组、HG+木犀草素组、HG+木犀草素+si-CTBP1-AS2组

2.6抑制CTBP1-AS2逆转木犀草素对高糖诱导的hRECs氧化应激损伤的影响 与HG组比较,HG+木犀草素组hRECs中SOD活性显著升高,MDA含量显著降低(P<0.05);与HG+木犀草素组比较,HG+木犀草素+si-CTBP1-AS2组hRECs中SOD活性显著降低,MDA含量显著升高(P<0.05)。见表3。

3 讨 论

近年研究表明,木犀草素具有广的细胞保护作用。Hong等〔10〕研究表明,在大鼠肾缺血再灌注损伤过程中,木犀草素降低缺血再灌注大鼠氧化应激、中性粒细胞浸润、炎症反应、肾细胞凋亡改善肾功能障碍和组织学损伤。Chen等〔11〕指出,木犀草素可提高过氧化氢作用下皮肤角质形成细胞的活力,提高抗氧化酶的表达,保护皮肤角质形成细胞免受ROS诱导的损伤。Yu等〔12〕证实,木犀草素可抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRP)3炎症小体形成,抑制高糖诱导的足细胞凋亡,对糖尿病肾病具有潜在治疗作用。糖尿病中过量活性氧的产生可氧化细胞蛋白、膜脂和核酸,加重hRECs受损,SOD是清除氧自由基的内源性抗氧化剂,其水平是机体氧化应激水平的阴性标志物〔13〕。本研究结果表明,木犀草素通过增强细胞抗氧化能力,抑制凋亡,进而保护hRECs免受高糖诱导的细胞损伤。

lncRNA是缺乏蛋白编码潜能的RNA转录本,其通过吸附miRNA间接影响miRNA靶mRNA的稳定性和翻译能力从而影响多种人类疾病进展,例如lncRNA H19可靶向miR-93上调xbp1表达进而抑制高血糖下视网膜上皮细胞的炎症反应〔14〕。已有研究证实,木犀草素通过下调致癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(BANCR)激活lncRNA(lnc-BANCR)表达抑制下游促甲状腺激素受体/细胞周期蛋白D1基因信号通路进而诱导甲状腺癌细胞G0/G1期阻滞,抑制细胞增殖〔15〕。木犀草素可抑制脂多糖诱导的肺泡上皮细胞活力丧失、细胞凋亡和炎症因子的表达,其机制与抑制miR-132表达有关〔16〕。本研究提示,木犀草素对高糖诱导的hRECs损伤的保护作用可能与调控CTBP1-AS2和miR-493-5p表达相关。目前关于CTBP1-AS2研究多集中在癌症中,研究表明CTBP1-AS2在宫颈癌、肝癌、胃癌中表达增加,参与癌细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药,具有致癌因子作用〔17～19〕。此外,有报道称lncRNA CTBP1-AS2可能通过抑制氧化低密度脂蛋白处理后血管平滑肌细胞的增殖并促进其自噬进而抑制动脉粥样硬化进展〔20〕。本研究表明,过表达CTBP1-AS2显著减弱高糖刺激对hRECs细胞SOD活性、MDA水平、细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响,保护hRECs免受高糖诱导的氧化应激损伤和凋亡,这与木犀草素对高糖诱导的hRECs的保护效果一致。进一步研究证实,CTBP1-AS2与miR-493-5p存在直接作用,过表达CTBP1-AS2可减弱高糖刺激对miR-493-5p表达的诱导作用,这表明在高糖诱导的hRECs中可能存在CTBP1-AS2/miR-493-5p调控途径。本研究结果表明,抑制CTBP1-AS2表达显著削弱木犀草素处理对高糖诱导的hRECs凋亡和氧化应激损伤的保护作用,表明木犀草素可能通过上调CTBP1-AS2/miR-493-5p途径进而对高糖诱导的hRECs损伤发挥保护作用。然而,本研究存在一定的局限性,木犀草素下游是否存在其他lncRNA/miRNA调控途径、miRNA的下游可能靶点仍需进一步确认。

综上所述,木犀草素可有效抑制高糖诱导的hRECs凋亡和氧化应激损伤,其机制可能是通过上调CTBP1-AS2/miR-493-5p途径实现的,这首次揭示了木犀草素在高糖诱导的hRECs损伤中的保护作用和分子机制。