基于TLR4/NF-κB研究苗药黑骨藤对AGA大鼠Th17/Treg及相关细胞因子的影响

党荣敏 蒋催蓉 谢洪书 罗康华 姚文琴

(黔南民族医学高等专科学校 1病原生物学教研室,贵州 都匀 558000;2病理学教研室;3微生物学及免疫学检验教研室)

急性痛风性关节炎(AGA)是由于尿酸盐沉积在关节囊、滑囊、软骨、骨质和其他组织中而引起病损及炎性反应,其会发生引起沉积关节部位的剧烈疼痛,严重情况下会导致关节畸形,造成不可逆的关节残疾,在一定程度上对人们生活质量造成不良影响〔1,2〕。目前临床上治疗此病以药物治疗为主,西药具有疗效不显著、需长期服药、不良反应较多等劣势,故寻找一种疗效显著、副作用较小的药物仍是目前学术研究的热点〔3〕。传统医学在临床各种疾病的疗效彰显优势,临床研究证实,传统医学不良反应少且具有“多靶点、多通路”的独特优势〔4〕。苗药黑骨藤具有良好的抗类风湿性关节炎作用,其作用机制可能与调节免疫器官功能及促进炎细胞因子水平有关〔5〕。但目前鲜少苗药黑骨藤在AGA中作用报道。本研究探究基于Toll样受体(TLR)4/核转录因子(NF)-κB研究苗药黑骨藤对AGA大鼠辅助性T细胞(Th)17/调节性T细胞(Treg)及相关细胞因子的影响。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物:选取90只SPF级雄性健康大鼠,由第三军医大学实验动物中心提供,体质量224～249 g,平均(225.62±10.44)g,将大鼠放置室温22～24 ℃,湿度40%～70%,12 h光照/12 h黑暗交替无病原菌干净笼子中饲养,饮用的水和食物均经消毒,统一喂给标准饲料,允许自由活动,饲养1 w。主要试剂:秋水仙碱购自西双版纳版纳药业有限责任公司,国药准字:H53021369,规格:0.5 mg;白细胞介素(IL)-1β酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于上海广锐生物科技有限公司(货号:elisa2013-0424)、IL-6 ELISA试剂盒购于武汉益普生物科技有限公司(货号:CK-E30646)、肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒购于上海臻科生物科技有限公司(货号:ZK-6601);TLR4抗体购于武汉菲恩生物科技有限公司(货号:FNab08727);NF-κB抗体购于深圳市豪地华拓生物科技有限公司(货号:PL0403111)。

1.2建模及分组 在90只SPF级雄性健康大鼠中选取15只作为正常组,其余大鼠参照薛舒月等〔6〕研究建立急性痛风性关节炎模型,在大鼠踝关节外后方和沿着与胫骨成45 °夹角方向将含有0.2 ml MSU悬混液的5号注射器插入右踝关节腔并注入,轻揉拉伸关节,帮助药物扩散至关节周围各部位,建模成功标准:各组踝关节均出现明显肿胀。建模成功后将大鼠随机分为模型组、秋水仙碱组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各15只。

1.3给药 药物按照10倍于60 kg人提高总折算为大鼠等效剂量,通过查阅相关文献及预实验的结果,苗药黑骨藤的剂量分别为:25、50、100 mg/kg,低、中、高剂量组分别给予25、50、100 mg/kg苗药黑骨藤灌胃,秋水仙碱组使用0.1 mg/kg的秋水仙碱灌胃,正常组、模型组给予相同体积的生理盐水灌胃,每日均在上午9点灌胃给药1次,持续给药7 d。

1.4样本采集 在第7天灌胃2 h后股动脉取血,分离血中单个核细胞进行Th17、Treg含量测定;同时分离血清及切取关节囊、分离关节滑膜组织,保存备用。

1.5Th17/Treg及相关细胞因子水平 采用美国BD公司Facs CantoⅡ型流式细胞仪测定Th17、Treg含量,计算Th17/Treg比值。采用ELISA测定IL-1β、IL-6、TNF-α水平,实验步骤按相关 ELISA试剂盒说明书操作。

1.6Western印迹检测TLR4、NF-κB蛋白表达 将蛋白缓冲液加入各组组织中并采用二喹啉甲酸(BCA)法对蛋白进行定量检测,随后取10 μl蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜,随后在其中加入适量一抗并封闭,过夜孵育环境为4 ℃,采用Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)对各组组织进行洗涤后加入适量二抗并孵育1 h,孵育环境为室温,对各组组织进行洗膜并加入等体积化学发光液A液、B液与PAGE膜反应,曝光显影,内参蛋白为磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。

1.7统计学处理 采用SPSS26.0软件进行方差分析,两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1Th17/Treg及相关细胞因子水平比较 高、中、低剂量组、秋水仙碱组及模型组Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显高于正常组,Treg明显低于正常组(P<0.05)。高、中、低剂量组、秋水仙碱组Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显低于模型组,Treg明显高于模型组(P<0.05)。高、中、低剂量组Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显低于秋水仙碱组,Treg明显高于秋水仙碱组(P<0.05)。高、中剂量组Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显低于低剂量组,Treg明显高于低剂量组(P<0.05)。高剂量组Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显低于中剂量组,Treg明显高于中剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组Th17/Treg及相关细胞因子水平比较

2.2TLR4、NF-κB蛋白表达量比较 高、中、低剂量组、秋水仙碱组、模型组TLR4、NF-κB蛋白表达量明显高于正常组(P<0.05),高、中、低剂量组、秋水仙碱组TLR4、NF-κB蛋白表达量明显高于模型组(P<0.05),高、中、低剂量组TLR4、NF-κB蛋白表达量明显高于秋水仙碱组(P<0.05),高、中剂量组TLR4、NF-κB蛋白表达量明显低于低剂量组(P<0.05),高剂量组TLR4、NF-κB蛋白表达量明显低于中剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组TLR4、NF-κB蛋白表达量比较

3 讨 论

AGA作为一种迁延性湿病时刻危害着人类健康,临床上多采用秋水仙碱和糖皮质激素控制患者临床症状,但不可避免会出现大量药物不良反应,如胃肠道反应、肾功能不全、骨髓抑制、皮疹、脱发等,在一定程度上可缓解临床症状,但复发率较高、不良反应较大,再加之部分患者依从性差、不能坚持服用,且到目前为止,暂无根治此病的药物〔7～9〕。中医在疾病治疗方面积累较多经验逐渐进入研究者的视野,且越来越多的研究发现中医药确实对AGA有一定疗效。黑骨藤是贵州苗族地区常用药物之一,是萝摩科植物西南杠柳的根或全株,其味苦、辛、性温、有小毒,具有活血消痈、祛风除湿的功效〔10,11〕。在杨婉珠等〔12〕研究中,黑骨藤醇提取物对急性心力衰竭大鼠具有一定的保护作用,机制可能与增强心肌超氧化酶活性,进而改善急性心力衰竭大叔体内氧化应激失衡及增强心脏泵血功能有关。既往研究显示〔13〕,黑骨藤追风活络胶囊中含有黑骨藤成分,针对西南地区高原风寒湿气候所诱导的风湿、类风湿关节炎患者具有较好的治疗效果,其中黑骨藤具有祛风除湿、活血通络、消痹止痛的功能,还具有较好的抗炎效果,但具体临床作用机制与治疗靶点未有深入挖掘。在本研究中,苗药黑骨藤在AGA治疗中,疗效显著,可有效降低炎性因子水平,缓解炎症反应。

众多研究显示〔14,15〕,AGA的发病关节局部伴随一些信号通路的激活或抑制,TLR4/NF-κB是其中最重要的信号通路之一,该通路的激活、细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的大量产生与AGA的发病与炎症表现密切相关。TLRs受体属于模式识别受体家族,可识别病原相关分子模式,其中TLR4为该家族研究最多的分子之一。TLRs为Ⅰ型跨膜受体,当其活化后通过TLR结合域与髓样分化分子结合并激活IL-1受体相关激酶,随后结合TNF受体相关因子6活化转化生长因子β活化激酶1,进而激活NK-κB〔16,17〕。NF-κB位于TLR4/NF-κB信号通路下游的重要节点,参与调节体内重要细胞因子、炎症因子、黏附因子等的表达,若NF-κB被激活,可促进IL-1β、IL-6等炎性细胞因子表达,产生炎症级联反应〔18,19〕。IL-1β在炎症反应中可促进并招募中性粒细胞、巨噬细胞,进而引起红、肿、热、痛等关节炎表现,同时释放的炎性物质可刺激巨噬细胞产生更多的IL-1β,加剧炎症反应〔20〕。有研究显示〔21〕,IL-1β可激活破骨细胞使其分化,还可作用于神经元、触发机体对炎症所致疼痛的过度敏感;TNF-α可通过相关信号通路促使IL-1β、IL-6等细胞因子分泌及中性粒细胞出现吞噬活性并释放氧自由基和蛋白水解酶,导致尿酸盐沉积处出现充血、水肿、大量炎症细胞浸润且不断加重。而研究发现〔22〕,AGA的发病过程中CD4+T细胞所参与机体免疫调节的Th具有重要的作用,其亚群失衡在痛风的发生和进展中具有重要作用。Th17、Treg细胞是CD4+T细胞在细胞因子的刺激下分化成的两个Th亚型,Th17细胞可分泌促炎因子,诱导单核细胞、巨噬细胞等炎症细胞分泌炎性因子和趋化因子,促进并加重炎症反应的发生;Treg细胞是负相免疫调节细胞,通过释放抑炎因子抑制机体过度免疫反应。本研究结果显示,经药物干预治疗后AGA大鼠TLR4、NF-κB蛋白表达量明显降低,Th17/Treg失衡被调控,且苗药黑骨藤作用优于秋水仙碱,呈剂量依赖,推测其作用机制可能与调节TLR4/NF-κB信号通路,促进Th17/Treg平衡,抑制关节组织炎症相关。

综上,苗药黑骨藤可通过下调TLR4、NF-κB蛋白表达量,抑制TLR4/NF-κB信号通路,降低Th17/Treg及相关细胞因子水平,减轻炎症反应,缓解急性痛风性关节炎疾病进展,起到治疗作用。