丹酚酸B对创伤后应激障碍大鼠神经特异核蛋白和神经生长相关蛋白43表达的影响

刘洋 陈红莲

(漯河医学高等专科学校,河南 漯河 462000)

创伤后应激障碍(PTSD)是一种主要因受到应激或创伤而产生的心理障碍疾病〔1〕。除了心理层面的症状,PTSD患者通常伴有学习记忆能力下降〔2〕。皮层和海马是学习和记忆形成过程中的重要脑区,同时也是创伤应激容易损伤的关键部位〔3〕。丹酚酸B是丹酚酸类物质中抗氧化作用最强的〔4〕。有文献报道丹酚酸B对脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定的改善作用〔5〕,也有研究表明丹酚酸B可以明显提高脑缺血大鼠的学习记忆能力〔6〕,以上研究说明丹酚酸B不仅可以作用于神经系统,还对学习记忆有影响。PTSD亦属于神经系统功能障碍性疾病,且易伴有认知功能损伤,但丹酚酸B和PTSD之间的相关研究报道比较少。本研究采用国际上认定的单次延长应激(SPS)方法建立PTSD大鼠模型,观察丹酚酸B对PTSD大鼠认知功能的影响及可能的作用机制,以期对PTSD的治疗提供有效的干预措施。

1 材料与方法

1.1试验药物 丹酚酸B(纯度≥ 98.0%,淡黄色粉末),购自成都曼思特生物科技有限公司,批号:MUST-13082008,称取一定量丹酚酸B粉末,加生理盐水配制成浓度为1 mg/ml药液备用。盐酸帕罗西汀片购于浙江华海药业股份有限公司,批号:H20031106,20 mg/片。

1.2动物 健康雄性SD大鼠,鼠龄2月龄,SPF级,体质量180～220 g,购于河南省实验动物中心,动物许可证号:SCXK(豫)2017-0004。适应性饲养1 w后开始实验。操作均严格按照相关规定进行。

1.3试剂 兔抗鼠NeuN多克隆抗体、兔抗鼠神经生长相关蛋白(GAP)43多克隆抗体均购自美国Sigma公司,批号分别为SAB430088、SAB4501101;Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)和Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)均购于碧云天生物技术有限公司,批号分别为A0423、A0516;超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所,批号分别为:20190322、20190326、20190219。

1.4仪器 Morris水迷宫装置购自中国医学科学院药物研究所,FluoView FV1200激光共聚焦显微镜购自日本OLYMPUS公司,UV-2000 紫外可见分光光度计购自尤尼柯(上海)仪器有限公司,大鼠固定器购自上海玉研科学仪器有限公司。

1.5动物分组及给药 将60只大鼠随机分为正常组、模型组、帕罗西汀组、丹酚酸B低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余各组采用单次延长应激(SPS)构建PTSD大鼠模型。模型制备结束的次日开始丹酚酸B组每天固定时间灌胃丹酚酸B(10、20、40 mg/kg),帕罗西汀(4.2 mg/kg)组灌胃帕罗西汀,给药体积为10 ml/kg。正常组和模型组灌胃给予相同体积的生理盐水。每天给药1次,连续14 d。

1.6PTSD大鼠模型制备 参照文献〔7〕,采用SPS方法构建PTSD大鼠模型,具体操作为:先将大鼠置于固定器中束缚2 h,然后强迫游泳20 min,随后休息15 min,再用乙醚麻醉至意识丧失,待其清醒后放回笼中正常喂养。

1.7Morris水迷宫实验 水迷宫为直径150 cm、高60 cm的圆形水池,注水深度为25 cm,直径为12 cm的平台置于水面下2 cm。(1)定位航行试验:在第1～5天,将大鼠面向池壁轻轻放入水中,任其自由游泳,观察大鼠在水池中的活动轨迹,记录大鼠找到平台的所用的时间。如果120 s后大鼠仍没有找到平台,用竹竿引导其到达平台,该大鼠逃避潜伏期计为120 s。最后将每只大鼠5 d的找平台所用时间平均化得到逃避潜伏期的值。(2)空间探索试验:在第6天,撤去平台,将大鼠于相同位置面向池壁放入水中,记录60 s内大鼠穿越原平台所在位置的次数,用于检测大鼠的空间记忆能力。行为学实验结束后进行后续指标检测。

1.8免疫荧光实验 将大鼠用10%水合氯醛麻醉,先用生理盐水进行心脏灌流至全身发白,然后用4%多聚甲醛灌流。随后断头,取出脑组织并置于4%多聚甲醛中后固定6 h。用冰冻切片机进行冠状切片,片子厚度为30 μm,经0.3 % TritonX-100通透2 h和10 % BSA 封闭1 h后,加入一抗(NeuN,1∶200;GAP43,1∶500),室温孵育2 h后,分别加入Cy3标记二抗和Alexa Fluor 488标记二抗,浓度比均为1∶1 000,室温避光孵育2 h,封片,镜检并拍照,利用Image pro plus6.0图像处理软件检测平均积分光密度(OD值)。皮层和海马神经元胞核内可见Cy3标记的红色荧光免疫反应阳性产物为NeuN蛋白。皮层和海马神经元胞膜上可见Alexa Fluor488标记的绿色荧光免疫反应阳性产物为GAP43蛋白。

1.9分光光度计检测血清SOD、MDA和GSH-PX含量 大鼠尾静脉取血后,离心,取10 μl血清按照试剂盒说明书进行SOD、MDA和GSH-PX含量的测定。

1.10统计学方法 采用SPSS21.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1丹酚酸B对PTSD大鼠空间学习记忆能力的影响 图1为水迷宫实验的第3天各组游泳路线,与正常组比较,模型组找到平台之前的游泳路线明显延长;与模型组比较,帕罗西汀组和丹酚酸B低、中、高剂量组找到平台之前的游泳路线明显缩短。与正常组比较,模型组逃避潜伏期明显延长,穿越原平台次数明显减少(P<0.01);与模型组比较,帕罗西汀组和丹酚酸B低、中、高剂量组逃避潜伏期明显缩短,穿越原平台次数明显增加(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 丹酚酸B对PTSD大鼠空间学习记忆能力的影响

图1 各组游泳路线(水迷宫实验)

2.2丹酚酸B对PTSD大鼠皮层和海马NeuN表达的影响 与正常组比较,模型组皮层和海马NeuN表达明显减少(P均<0.01);与模型组比较,帕罗西汀组和丹酚酸B低、中、高剂量组皮层和海马NeuN表达明显增多(P均<0.01)。见图2、表2。

表2 丹酚酸B对PTSD大鼠NeuN和GAP43表达、SOD、MDA和GSH-PX含量的影响

图2 丹酚酸B对PTSD大鼠皮层和海马NeuN、GAP43表达的影响(免疫荧光染色,×200)

2.3丹酚酸B对PTSD大鼠皮层和海马GAP43表达的影响 与正常组比较,模型组皮层和海马GAP43表达明显减少(P<0.01);与模型组比较,帕罗西汀组和丹酚酸B低、中、高剂量组皮层和海马GAP43表达明显增多(P<0.01)。见图2、表2。

2.4丹酚酸B对PTSD大鼠血清SOD、MDA和GSH-PX含量的影响 与正常组比较,模型组血清SOD、GSH-PX含量明显减少,MDA含量明显增多(P<0.01);与模型组比较,帕罗西汀组和丹酚酸B低、中、高剂量组血清SOD、GSH-PX含量明显增多,MDA含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。

3 讨 论

目前PTSD发病机制尚不清楚。但从众多临床病例和实验研究中可以发现,学习记忆功能的减弱是PTSD的主要症状。Morris水迷宫是国内外通用的检测动物学习记忆能力的方法〔8〕,本研究结果说明各组大鼠都有一定的学习记忆能力,提示SPS可以导致大鼠学习记忆损伤,而丹酚酸B可以一定程度地逆转这种损伤,效果同阳性药物帕罗西汀。

学习与记忆的形成是一个掺有多种机制的复杂的过程,目前得到普遍认可的是与神经元的缺失、突触可塑性的改变密切相关。NeuN广泛分布于神经系统的脑区,如皮层、海马、小脑等,NeuN表达下降指示神经元丢失,因此NeuN通常被作为神经元的特异性标志物,直接决定突触传递效能可否正常进行〔9〕。GAP43又称神经调节蛋白,是一种神经特异性的钙调素结合蛋白质,参与神经生长和神经再生,同时能调节轴突的长度,改变细胞形态等,在突触可塑性的过程中发挥重要作用〔10〕。GAP-43不仅是突触生长发育的标志性蛋白,也可以作为反映学习记忆能力的标志性蛋白。本研究结果提示,创伤应激可以使脑组织内NeuN和GAP43表达下调,而丹酚酸B可以逆转这种下调。当机体尤其是神经系统处于应激状态时,活性氧(ROS)自由基水平会大幅提高,体内氧化系统与抗氧化系统之间的平衡即会打破,自由基的过度生成会超出抗氧化剂的清除作用而呈现氧化应激状态。抗氧化酶SOD、GSH-PX是典型的抗氧化物质,脂质过氧化产物MDA是典型的氧化物质。研究证明,氧化应激是促进PTSD发生发展的重要环节。而具有多酚类结构的丹酚酸B是一种很好的自由基清除剂。有文献报道丹酚酸B通过降低小鼠肝脏中GSH含量使抗氧化系统趋于正常,降低肝损伤程度〔11〕;丹酚酸B还可以通过提高SOD含量、下调MDA和LDH含量,缓解氧化应激反应,对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织起保护作用〔12〕。本实验结果与上述报道一致。

综上,丹酚酸B可以改善PTSD大鼠学习记忆能力,具有一定的神经保护作用,其机制可能与改善突触可塑性,抑制氧化应激反应有关。