金雀异黄素对脑卒中大鼠小胶质细胞激活及HMGB1/TLR4通路的影响

赵汉清 冯鹏超 张霞 杜莹莹 贾评

(河北北方学院附属第二医院 1中医科,河北 张家口 075100;2中医针灸科;3消化科;4急诊科;5药剂科)

脑卒中是全球人类发病率、死亡率增加的主要原因之一,小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞,是抵御损伤的第一道防线,当脑缺血发生时,其会被立即激活,发挥重要作用〔1、2〕。在缺血性脑卒中的病理阶段,M1型小胶质细胞可产生白细胞介素(IL)-1β等促炎介质损害神经系统,而M2型小胶质细胞的特征是产生IL-10等抗炎因子及血管内皮生长因子等生长因子来促进血管生成,起到神经保护作用〔2〕,因此,有效抑制小胶质细胞激活,促进其M1/M2的转化对疾病的治疗具有重要意义,所以,了解脑卒中小胶质细胞的激活及转化机制十分必要。高迁移率族蛋白(HMG)B1作为具有促炎活性的细胞因子样介质,已被报道与缺血性脑神经炎症和损伤有关〔3〕,有研究发现,降低HMGB1/Toll样受体(TLR)4介导的炎症通路激活可抑制氧糖剥夺和再灌注诱导的小胶质细胞活化及炎症因子的释放,从而改善小胶质细胞损伤〔4,5〕。金雀异黄素可通过降低氧化应激及免疫炎症反应,在脑缺血模型中发挥脑保护作用〔6,7〕。有研究发现,金雀异黄素可通过阻断HMGB1信号来促进糖尿病小鼠眼角膜和神经伤口的恢复,但关于金雀异黄素在脑卒中对该通路的影响还未见报道〔8〕。因此本研究通过探究金雀异黄素对脑卒中大鼠小胶质细胞激活及HMGB1/TLR4的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 自河南省实验动物中心购买的50只SD大鼠(体质量200～250 g,SPF级),许可证:SCXK(豫)2017-0001,于室温(25±13)℃且通风良好的饲养环境中喂养7 d(光照/黑暗为12 h/12 h)。

1.2主要试剂 二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(SLF-23227,武汉极捷生物科技有限公司);兔抗OX-42抗体(bs-7131R,杭州昊鑫生物科技股份有限公司);辣根过氧化物酶(HRP)-IgG抗体、兔抗离子钙结合衔接分子(Iba)1、HMGB1、TLR4、β-actin、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体(ab13243、ab5076、ab18256、ab13556、ab8227、ab15323,Abcam);兔抗精氨酸酶(Arginase)抗体(93668,Cell Signaling Technology);IL-1β、IL-10试剂盒(EK0418,上海和序生物科技有限公司);IL-1β试剂盒(YM-SZ1583,上海远慕生物科技有限公司);原位缺口末端标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(YT136,北京百奥莱博科技有限公司);Omega Fluor 凝胶成像系统(环亚生物科技有限公司);帝肯酶标仪Tecan光吸收酶标仪Sunrise(湖南中瑞互信医疗科技有限公司)。

1.3分组与模型构建 将SD大鼠(50只)随机分为假手术组、模型组、低剂量组(5 mg/kg金雀异黄素)、高剂量组(10 mg/kg金雀异黄素)〔7〕、高剂量+甘草酸组(10 mg/kg金雀异黄素+0.03 g/kg HMGB1抑制剂)〔9〕各10只。脑卒中模型大鼠构建:戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,乙醇消毒后固定大鼠使颈部暴露,切开皮肤,暴露左侧颈内、外动脉,在内外动脉分叉膨大处切口,于切口端颈内动脉插入尼龙线(20 mm),将尼龙线与颈内动脉结扎后缝合皮肤,注射青霉素以防止感染,使用Longa评分于大鼠造模2 h后验证模型是否成功,若评分为1～3分则表明造模成功〔10〕,造模成功率100%;对照组大鼠仅暴露左侧颈内、外动脉,不进行插线及结扎;造模成功后次日,低剂量组、高剂量组、高剂量+甘草酸组大鼠腹腔注射相应剂量药物,假手术组、模型组注射等量生理盐水共2 w(1次/d)。

1.4大鼠神经行为学评分 于造模结束及实验结束参照Longa评分对大鼠神经功能进行评分:0分:正常、无神经缺损体征出现;1分:对侧前爪不能完全伸展;2分:提尾后向外侧方向转圈;3分:行走时向对侧跌倒;4分:无法自发行走、意识昏迷〔11〕。

1.5TUNEL法检测脑组织神经细胞凋亡情况 随机选出5只大鼠取其脑组织按照常规方法制作石蜡切片(4 μm),一部分使用蛋白酶K(2%)孵育(20 min)后PBS洗涤,加入TUNEL反应液孵育(1 h),用含4′,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)的抗荧光猝灭液封片,荧光显微镜观察并拍照,观察脑组织凋亡阳性细胞数,ImageJ软件进行统计;其余切片进行免疫组化实验。

1.6免疫组化法检测脑组织中Iba1表达 将1.5所得切片(n=5)置于过氧化氢中孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性,孵育山羊血清(30 min)后加Iba1一抗孵育过夜,于次日孵育生物素标记的二抗(20 min),磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后滴加二氨基联苯胺(DBA)显色、中性树脂封片后Image Pro Plus6.0观察并进行棕黄色阳性细胞计数(×400)。

1.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑组织IL-1β、IL-10水平 取出剩余全部大鼠的脑组织于冰上进行匀浆,离心(12 500 r/min、25 min)后取上清液,一部分使用ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-10含量,其余进行后续Western印迹。

1.8Western印迹检测Arginase、iNOS蛋白及HMGB1/TLR4通路蛋白表达 通过蛋白浓度检测试剂盒对1.7所得上清液中蛋白浓度进行定量,取30 μg蛋白样品加入已配制好的分离胶中进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜、封闭(5%牛血清白蛋白,1 h),一抗(兔抗Arginase、iNOS、HMGB1、TLR4、β-actin抗体,1∶2 000)孵育过夜,二抗(山羊抗兔HRP-IgG)孵育1 h,电化学发光(ECL)显影后使用蛋白凝胶成像仪进行观察,使用ImageJ分析各蛋白条带灰度值,计算Arginase、iNOS、HMGB1、TLR4水平。

1.9统计学方法 采用SPSS25.0软件进行方差分析,两两比较采用SNK-q法。

2 结 果

2.1金雀异黄素对各组神经功能的影响 与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分显著增加(P<0.05);与模型组比较,低剂量组及高剂量组神经功能缺损评分显著降低(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+甘草酸组神经功能缺损评分显著降低(P<0.05),见表1。

表1 各组神经功能、大脑神经细胞凋亡率、IL-1β及IL-10水平

2.2金雀异黄素对脑组织IL-1β及IL-10水平的影响 与假手术组比较,模型组IL-1β水平显著升高,IL-10水平则显著降低(P<0.05);与模型组比较,低剂量组及高剂量组IL-1β水平显著降低,IL-10水平显著升高(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+甘草酸组IL-1β水平显著降低,IL-10水平显著升高(P<0.05),见表1。

2.3金雀异黄素对各组神经细胞凋亡的影响 与假手术组比较,模型组大脑神经细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与模型组比较,低剂量组及高剂量组神经细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+甘草酸组神经细胞凋亡率显著降低(P<0.05),见表1、图1。

图1 各组大脑神经细胞凋亡(×400)

2.4金雀异黄素对各组脑组织Iba1表达及小胶质细胞形态的影响 与假手术组比较,模型组脑组织Iba1阳性细胞数显著增加(P<0.05);与模型组比较,低剂量组及高剂量组Iba1阳性细胞数显著降低(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+甘草酸组Iba1阳性细胞数显著降低(P<0.05),见表1;假手术组小胶质细胞数量极少,存在分支状突起且突起细长,胞体瘦长,均未活化;模型组小胶质细胞数量增加、突起增多变粗连接成网状、体积增大,呈活化状态;与模型组比较,低剂量组及高剂量组小胶质细胞突起变细,数量减少;与高剂量组比较,高剂量+甘草酸组小胶质细胞活化数进一步减少,见图2。

图2 各组小胶质细胞(免疫组化染色,×400)

2.5金雀异黄素对脑组织Arginase及iNOS表达的影响 与假手术组比较,模型组iNOS表达水平显著升高,Arginase表达显著降低(P<0.05);与模型组比较,低剂量组及高剂量组iNOS表达显著降低,Arginase表达显著升高(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+甘草酸组iNOS表达显著降低,Arginase表达显著升高(P<0.05),见表2、图3。

1～5:假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组、高剂量+甘草酸组;下图同图3 各组脑组织Arginase及iNOS表达

表2 各组脑组织Arginase及iNOS表达

2.6各组脑组织HMGB1/TLR4通路蛋白表达 与假手术组比较,模型组HMGB1、TLR4表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,低剂量组及高剂量组HMGB1、TLR4表达显著降低(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+甘草酸组HMGB1、TLR4表达显著降低(P<0.05),见图4、表3。

图4 各组脑组织HMGB1/TLR4通路蛋白表达

表3 各组脑组织HMGB1/TLR4通路蛋白表达

3 讨 论

脑卒中包括缺血性与出血性,其中以缺血性为主,由脑血管血流受阻所导致〔12〕。缺血性脑卒中已成为全球人类死亡的第二大主要原因,并且具有极高的致残率,对患者及其家庭造成极大的负担〔12〕。小胶质细胞是中枢神经系统中的重要免疫细胞,活化的小胶质细胞是大脑中细胞因子、生长因子、趋化因子的主要来源,而这些分子与脑卒中继发性脑损伤及脑组织修复密切相关,因此了解其活化机制,对寻找新的脑卒中治疗药物及研究其治疗机制极其关键。

金雀异黄素是一种存在于大豆食品中的异黄酮植物雌激素,已被证明可防止缺血性脑卒中造成的脑损伤〔7,13〕。金雀异黄素能够通过促进磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路激活来减轻去卵巢模型大鼠脑组织神经元凋亡,从而起到神经保护作用〔14〕。当受到刺激后,小胶质细胞会被迅速激活并分化为M1或M2型,M1小胶质细胞通过分泌促炎因子,参与组织损伤,M2通过分泌抗炎因子或神经营养因子来促进组织修复〔12〕。金雀异黄素-3′-磺酸钠作为金雀异黄素的磺化产物可通过促进α7烟碱乙酰胆碱受体表达来抑制NF-κB信号传导,以此减少小胶质细胞M1极化,从而减轻神经炎症,防止缺血性脑卒中大鼠脑损伤的发生〔13〕。本研究结果表明,金雀异黄素能够有效抑制脑卒中大鼠小胶质细胞激活,促进其M1/M2型转化,改善脑损伤。

HMGB1作为危险相关分子模式分子,是TLR4信号激活的重要配体,前者在永久性大脑中动脉栓塞大鼠血清中大量积累〔15,16〕。HMGB1与跨膜受体RAGE及TLR4结合可激活核转录因子NF-κB,增强炎症反应〔17〕。桃红四物汤可通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路来降低NLRP3炎症小体的激活水平,从而抑制大脑中动脉闭塞再灌注大鼠的细胞焦亡〔17〕。多效性肽phoenixin 14通过抑制HMGB1/TLR4通路激活来减少大脑中动脉栓塞模型大鼠脑梗死体积及小胶质细胞活化,从而起到脑保护作用〔18〕。金雀异黄素能通过下调HMGB1和其受体TLR4及IL-1β表达来促进糖尿病小鼠神经伤口的愈合〔8〕。本研究结果表明,金雀异黄素能够有效抑制脑卒中大鼠HMGB1/TLR4通路的激活。除此之外,本研究结果还表明,金雀异黄素可能通过抑制HMGB1/TLR4通路来抑制脑卒中大鼠小胶质细胞激活,促进M1/M2型的转变。

综上,金雀异黄素可抑制脑卒中大鼠小胶质细胞激活,促进其M1向M2型的转变,以此改善脑损伤,其作用机制可能与金雀异黄素抑制HMGB1/TLR4通路有关。本研究不仅为脑卒中治疗机制的研究提供参考,还对金雀异黄素在脑卒中作用机制的研究具有重要意义,但由于时间及模型数量的限制,未进行更加深入的探究,但在接下来会继续对研究内容进行补充。