银黄可溶性粉对奶牛隐性乳房炎的治疗作用

陈 茜,黄雪利,武 超,赵微微,秦俊杰,侯晓礁

(1.南京农业大学动物医学院,江苏南京 210095;2.北京生泰尔科技股份有限公司,北京 102600;3.北京市中兽药工程技术研究中心,北京 102600)

奶牛乳房炎是奶牛常见的乳房疾病之一,临床发病原因复杂,是牛体状况、奶牛所处的饲养环境因素以及接触的病原微生物共同作用产生的结果。其中病原微生物感染,尤其是大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等病原微生物感染是引起奶牛乳房炎的主要病因[1]。隐性乳房炎为无临床症状表现的一种乳房炎,其特征是乳房和乳汁无肉眼可见异常变化、然而乳汁在理化性质、细菌学上一发生变化,故临床上不易发现,以致常常不被人们所重视[2]。隐性乳房炎常导致奶牛产奶量、乳质量下降,不仅降低经济价值,后续高昂的治疗费用也给畜牧业造成严重的经济损失[3]。目前临床常用治疗方法以抗生素治疗为主[4],但由于长期滥用抗生素造成乳汁中药物残留和细菌耐药性的问题,在很大程度上也让兽医不得不慎重使用抗生素[3]。由于中兽药具有低毒、无残留、疗效确切等优点,且随着中兽药的发展也越来越受到临床关注。用Mete分析法对中药治疗奶牛乳房炎临床试验进行系统评价,结果显示,复方中药对奶牛乳房炎的疗效显著优于青链霉素[5],还有文献报道,用中兽药可以使病原菌耐药率下降[6]。银黄可溶性粉是金银花和黄芩提取物,具有清热解毒、抗细菌等功效[7]。体外抑菌试验表明,银黄可溶性粉对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、无乳链球菌的最小抑菌浓度分别为4.8×10-3、3.5×10-3、2.4×10-3g/mL,银黄可溶性粉对奶牛乳房炎致病菌有明显的抑菌作用,对奶牛乳房炎有很好的防治作用[8]。本试验以中兽药银黄可溶性粉为试验药物对患有隐性乳房炎奶牛进行临床治疗,通过不同剂量的银黄可溶性粉治疗效果观察,来确定银黄可溶性粉的最佳治疗剂量,旨在开发一种经济、有效、安全的中兽药制剂治疗奶牛隐性乳房炎。

1 材料与方法

1.1 材料

患牛年龄3～6岁,胎次2～3胎,泌乳期相近,患牛只患有隐形乳房炎无其他疾病。不用有药品过敏史的患牛、有典型的临床型乳房炎症状的患牛、并发有其他疾病的患牛、试验期间继发其他疾病的患牛、正在参加其他临床试验的患牛、未按疗程服药、中途换药或混用其他药物的患牛。

1.1.2 试验菌株 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、无乳链球菌由北京生泰尔科技股份有限公司诊断中心提供。

1.1.3 主要试剂 银黄可溶性粉(每100 g本品相当于原生药75 g),爱迪森(北京)生物科技有限公司产品;万乳康(500 g/袋,每500 g本品相当于原生药500 g),安徽佰斯特生物科技有限公司产品;LMT诊断液,中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所。普通营养琼脂培养基、普通肉汤培养基、马丁肉汤培养基,青岛海博生物技术有限公司生产。

1.1.4 主要仪器 丹麦福斯 MilkoScanTM Minor体细胞测定仪、上海雷磁电子pH计、电子秤等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 将50头隐性乳房炎患牛,随机分为5组,每组10头。阳性药物组,每头牛灌服万乳康130 g/d;银黄可溶性粉试验组分别按每头牛10、15、20 g/d的剂量灌服银黄可溶性粉水溶液。给药方法为:将上述剂量药物以温开水溶解成1 000 mL,连续给药7 d,停药后继续观察10 d。空白对照组用同样方法每头牛灌服1 000 mL/d温开水。给药前记录各组奶牛的基线资料,主要为入组奶牛的年龄、产奶量及胎次水平。

1.2.2 LMT检测及判定 分别于试验第0天、第8天和第17天采集新鲜乳样进行LMT检测。检验方法参照中国农业科学院兰州畜牧与兽医研究所制定的奶牛隐性乳房炎现场诊断法进行检测诊断(表1)。

表1 奶牛隐性乳房炎判定标准(LMT)

1.2.3 乳汁体细胞计数 分别于试验第0天、第8天、第17天采集各试验组牛的4个乳区乳样。各乳区在采样前,弃去前2把奶,挤出乳样,每个乳区各收集乳汁50 mL,放入有防腐剂的采样管中,4℃保存运送到实验室检测各试验组奶样中乳汁体细胞总数。

1.2.4 乳汁pH 分别于试验第0天、第8天、第17天采集各试验组牛的4个乳区乳样。各乳区在采样前,弃去前2把奶,挤出乳样,每个乳区各收集乳汁50 mL,放入采样管中,立即送至实验室进行pH计检测,以蒸馏水清洗pH计电极头,将乳样放置烧杯中,检测前摇动烧杯使乳样均匀,检测时电极头全部浸入乳样,读取数值。

利用CaO与CO2反应吸附脱除CO2以及CaCO3分解为CaO与CO2的钙循环过程，不仅普遍适用于烟气脱碳（如燃烧后钙基循环脱碳[3]），还可用于化学化工过程（如乙酸重整反应吸附强化制氢[4-5]）。CaO不仅具有较高的CO2摩尔吸附容量（理论上为0.786 g CO2/gCaO），而且广泛存在于天然石灰石中，其脱碳成本较低，具有极大的经济优势[6]。因此充分了解CaO基CO2吸附剂的吸附与释放机理，对提高CO2吸附剂重复循环使用，降低钙循环脱碳技术成本，具有重要的科研价值与实际意义[7]。

1.2.5 银黄可溶性粉体外抑菌试验

1.2.5.1 供试菌液制备 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌用普通肉汤培养基培养,无乳链球菌用马丁肉汤培养基培养,将上述菌种接种后置于37℃恒温箱中18～24 h进行复苏培养,取出后生理盐水稀释100倍作为供试菌液,备用。

1.2.5.2 银黄可溶性粉稀释方法 取20 g银黄可溶性粉溶解于75 mL灭菌的纯化水中,制备成200 mg/mL生药量的银黄可溶性粉溶液,取8支灭菌试管,第1和第2支试管分别放入200 mg/mL生药量的银黄可溶性粉溶液,第2～第7支试管用灭菌生理盐水将溶液分别进行2倍稀释,分别得到浓度相当于含生药量 200 、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56 mg/mL银黄可溶性粉溶液。

1.2.5.3 抑菌试验 取无菌48孔培养板(8×6),选取1横排(8个孔)作为试验组,在试验组1～8孔中全部加入0.5 mL双倍浓度的培养基,然后在第1孔中加入0.5 mL上述梯度浓度的银黄可溶性粉溶液,混合均匀,各孔加入10 μL供试菌液,同时设培养基阴性对照孔和培养基加菌的阳性对照孔,37℃恒温培养16～18 h。观察各试管有无细菌增长,当阳性对照孔观察到浑浊时,观察各试验组有无细菌增长(肉眼观察变浑浊为有菌增长,记为“+”,反之则无,记为“-”),无肉眼可见细菌生长的最低银黄可溶性粉溶液浓度,即为银黄可溶性粉溶液对该菌种的最小抑菌浓度。每种菌株抑菌试验重复2次。

1.2.6 疗效评价标准 分别在试验的第0天、第8天、第17天对所有试验奶牛的每个乳区进行LMT检测,统计各试验组奶牛患病乳区隐性乳房炎积分变化情况,按照文献[10]评价药物效果。

治愈乳区:患病乳区(≥1分)LMT检测积分减少至0分,乳汁的体细胞数降低到50万/mL以下,pH降低到正常范围(6.40～6.60);

有效乳区:患病乳区LMT检测积分值与用药前相比减少,乳汁的体细胞数和pH均有所降低;

无效乳区:患病乳区LMT检测积分值与用药前相比不变或增加,乳汁的体细胞数未降低甚至出现升高,pH未降低甚至出现升高;

乳区积分减少率=(给药前总积分-给药后总积分)/给药前总积分×100%

治愈率=治愈乳区数/患病乳区数×100%

有效率=有效乳区数/患病乳区数×100%

1.2.7 统计分析 应用SPSS20.0软件进行统计学分析,计量数据以“平均数±标准差”表示,计量资料的比较用单因素方差分析或t检验;计数资料的比较用卡方检验,P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 入组试验动物情况

选择了50头平均年龄4.29岁,平均胎次2.67,平均每头产奶量为23.86 kg/d的中国荷斯坦奶牛作为试验用牛。5组试验牛在年龄、产奶量以及胎次水平无显著差异(P>0.05)(表2)。

表2 各组试验奶牛基线资料比较

2.2 LMT检测结果

空白对照组在不治疗情况下,有少数奶牛存在自愈情况,试验第8天和第17天,自愈率分别为3.13%和6.25%,但总体乳区积分上升,说明不使用药物治疗患病奶牛自愈率较低。试验第8天时,银黄可溶性粉高、中、低剂量组的有效率分别为84.38%、81.82%、64.52%;阳性药物组的有效率略高于低剂量组66.67%,各用药组与空白对照组相比差异均显著(P<0.05)。试验第17天时,有效率最高的是银黄可溶性粉高剂量组为87.50%,中剂量组次之为84.85%;阳性药物组有效率显著低于银黄可溶性粉高剂量组(P<0.05),为63.33%;各用药组与空白对照组相比,差异均显著(P<0.05)(表3)。

表3 各组奶牛乳区LMT检测结果积分统计

在治愈率方面,试验第8天时,银黄可溶性粉高、中剂量组达到了75.00%和72.73%的治愈率,低剂量组和阳性药物组的治愈率也达到了53.33%以上。试验第17天时,银黄可溶性粉中剂量组的治愈率最高为75.76%,其他各用药组的治愈率也保持在54.84%以上。整个试验过程中,各用药组的治愈率与空白对照组相比差异均显著(P<0.05)。

试验第8天各药物试验组的乳区LMT积分都有明显下降,其中银黄可溶性粉中剂量组下降程度最明显,达到69.49%,银黄可溶性粉高剂量组下降幅度也达到67.21%,均高于阳性药物组50.88%的降幅;而空白对照组的乳区积分反而上升高了5.45%,在试验第17天,即停药10 d后,空白对照组乳区积分升高了9.09%(表4);银黄可溶性粉高剂量组乳区积分下降率最高,达到了68.85%;其次分别为阳性药物组、银黄可溶性粉中、低剂量组。

表4 不同时间段乳区积分减少率

2.3 乳汁体细胞计数和pH

给药前各试验组平均乳汁体细胞数均在100万/mL以上,乳汁pH 6.89～7.14,两个指标各组之间差异均不显著(P>0.05)。试验第8天,各给药组体细胞数、pH均有不同幅度下降,其中银黄可溶性粉高、中剂量组效果最好,各用药组与空白对照组相比差异均显著(P<0.05);银黄可溶性粉高、中剂量组与阳性药物组相比差异显著(P<0.05)。试验第17天,即停药10 d后,银黄可溶性粉高、中剂量组和阳性药物组体细胞数、pH与空白对照组相比差异显著(P<0.05)(表5)。

表5 乳汁体细胞数(百万/mL)和pH的检测结果

2.4 银黄可溶性粉对隐形乳房炎常见致病菌的影响

由表6可知,对无乳链球菌MIC为3.13 mg/mL生药量,对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌MIC均为6.25 mg/mL生药量。上述结果表明,银黄可溶性粉对隐形乳房炎常见致病菌有较好的抑菌作用。

表6 银黄可溶性粉对奶牛乳房炎常见致病菌的最低抑菌浓度(mg/mL生药量)

3 讨论

奶牛乳房炎是泌乳期奶牛最常见的疾病之一,据国际奶牛联合会统计,世界范围内,临床型乳房炎发病率20%,隐性乳房炎发病率高达50%,而在我国隐性乳房炎发病率更高。研究发现,奶牛隐性乳房炎发病率与年龄、胎次也有一定关系,4胎前发病率随胎次增加而降低,究其原因可能是胎次少奶牛的乳腺发育还未完全成熟;而4胎后随胎次增加而增加,其原因可能是长期的产犊和泌乳,乳房接触病原微生物几率大大增加。同时由于长期泌乳挤奶,乳头的形状和机能都发生变化,对外源微生物的易感性增加,导致隐性乳房炎的发病率呈上升趋势[11]。研究表明,随着泌乳期的过渡奶牛隐性乳房炎的发病率有所增加,说明隐性乳房炎的发生与泌乳期关系密切。为减少各组间动物选择的偏倚性,本试验中选择3～6岁、2～3胎、泌乳期相近奶牛作为研究对象,本试验5组奶牛基线资料比较结果表明试验牛在年龄、产奶量以及胎次水平无显著差异,说明入组试验牛各组间基线具有可比性。

西兽医认为隐性乳房炎通常是由于多种致病的病原微生物通过污染乳房或者通过乳腺侵入乳房中造成发病[12]。乳房炎属于中兽医学中的奶肿、奶黄、乳痈等范畴,多因使役负重太过,奔走太急,或食精料过多,致使胃热壅盛,气血凝滞,又因乳房是胃热壅盛,胃脉受阻,乳房经气阻塞,遂成乳痈。本试验中银黄可溶性粉主要由金银花、黄芪组成,具有清热解毒、宣肺燥湿的功效。现代药理研究表明,金银花在解热抗炎、抗菌、抗病毒、护肝利胆以及增强免疫力等方面均有较显著功效[13]。金银花提取液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、黑曲霉等均表现出一定的抑制作用,起抑菌作用的主要成分为绿原酸、异绿原酸[14]。日粮中添加金银花提取物1 g/kg或2 g/kg可显著降低乳体细胞数[15]。金银花-板蓝根药对中活性成分可能与炎症密切相关的靶标COX-2有关,推测“金银花-板蓝根”药对可能调节关键靶标COX-2在炎症中发挥作用[16]。发酵黄芪可有效降低乳体细胞数,提高奶牛产奶量,其原因可能是黄芪能够提高奶牛的机体免疫力,从而使乳房炎感染率大大降低[17]。银黄可溶性粉体外对金葡菌,凝固酶阴性葡萄球菌,大肠埃希氏菌,无乳链球菌等有较好的抑制作用,对奶牛乳房炎致病菌体外抑菌作用及具有临床预防奶牛乳房炎的作用。综上所述,从现代学药理研究角度看,银黄可溶性粉有一定的抗炎、抗菌、增强免疫力以及降低乳汁中体细胞数的作用。

本研究中,用药后银黄可溶性粉高、中剂量组的有效率和治愈率相当,均达到81%、72%以上,阳性药物组和低剂量有效率和治愈率相当,均达到63%、53%以上,停药后10天银黄可溶性粉中剂量组的治愈率(75.76%)最大。在乳区LMT积分方面,各药物试验组的乳区LMT积分都有明显下降,其中银黄可溶性粉中剂量组下降程度最明显。而空白对照组的乳区积分反而升高了,表明奶牛隐性乳房炎在不用药情况下自愈率低。在降低乳汁中体细胞数、pH方面,用药后银黄可溶性粉和万乳康均有降低乳汁中体细胞数、pH的效果,用药第8天银黄可溶性粉高、中剂量组的作用效果更为显著。体外抑菌试验结果提示,银黄可溶性粉对奶牛隐形乳房炎有普遍抑菌作用。上述结果表明,银黄可溶性粉和万乳康对奶牛隐性乳房炎均有较好的治疗效果,其中银黄可溶性粉不仅起效速度更快,在合适的剂量范围内,其整体作用效果明显优于万乳康,此外,与万乳康相比,临床使用量少,成本更低,更适于推广使用。银黄可溶性粉主要药材具有抗炎、抗菌、降低乳汁中体细胞的作用,这与奶牛隐性乳房炎的病因密切相关,故可以在临床上取得很好的治疗效果。兼顾治疗效果和节约成本,推荐银黄可溶性粉的临床使用剂量为每头牛每天15 g,连续使用7 d。