盐胁迫下宁夏枸杞苯丙烷代谢相关基因差异表达分析

宋 繁,胡进红,梁旺利,梁文裕,王玲霞

(宁夏大学 生命科学学院, 银川 750021)

宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是主要分布于宁夏、内蒙古、新疆等干旱或半干旱地区的多年生灌木,其果实具有很高的药用和营养价值,是当地重要的栽培药用植物资源。同时,宁夏枸杞适宜在盐碱、干旱和沙荒地种植,具有较强的耐盐性。长期的盐生环境使宁夏枸杞进化出了一系列适应盐胁迫的机制,包括离子选择性吸收[1]、渗透调节物质积累[2]、活性氧自由基(ROS)清除[3]和叶片超微结构改变等[4]。目前越来越多的研究表明宁夏枸杞可通过形态结构、生理生化及分子水平等方面的变化协同适应盐胁迫。

植物苯丙烷代谢途径是合成酚类、类黄酮和木质素等次生代谢物的主要途径。这些次生代谢物构成植物体内重要的非酶抗氧化防御系统,可以清除过多的ROS,减缓植物在逆境胁迫下的膜脂过氧化和其他氧化损伤。研究发现通过改变苯丙烷代谢途径中相关基因的表达水平,进而调控酶活性及代谢物质积累是植物应对非生物胁迫的一种重要防御机制[5]。

盐胁迫下草莓[6]、红果龙葵[7]、刺柏[8]、鼠尾草[9]和秋茄[10]通过上调苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、类黄酮-3-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、黄酮醇合酶(FLS)和查耳酮合成酶(CHS)等苯丙烷代谢途径相关基因的表达,促进酚类、类黄酮物质的积累,使得这些植物的耐盐性提高。

此外,盐胁迫可通过诱导类黄酮合成相关基因F3H和查耳酮异构酶基因(CHI)的表达来提高胡萝卜对盐的耐受性[11]。拟南芥盐驯化过程中与木质素合成相关的7个基因表达上调,促进木质素的合成,使拟南芥细胞壁木质化、减少水分蒸腾,维持正常的膨压[12]。

由此可见植物酚类、类黄酮和木质素等的合成与植物耐盐性具有明显的相关性,研究其合成相关基因的差异表达有利于阐明植物耐盐机制。但是目前对于宁夏枸杞酚类、类黄酮、木质素这类化合物合成相关基因如何表达以适应盐胁迫还鲜见报道。因此,本研究利用高通量测序技术和实时荧光定量技术对盐胁迫下宁夏枸杞苯丙烷代谢途径中相关基因的表达规律进行分析,并对该途径中关键酶的活性及产物含量进行测定,为进一步研究宁夏枸杞耐盐机制提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

试验所用品种‘宁杞1号’种子由宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所惠赠。枸杞种子经萌发1 d后种植于花盆(6.5 cm×7.5 cm)中,以珍珠岩、蛭石与基质按 1∶1∶1 比例混合作为培养基质,用Hoagland营养液进行浇灌。在温度(25 ± 2) ℃、湿度42%、光强60 μmol/(m2·s)、光照时间12 h 的条件下进行培养。1个月后,选择长势一致且健康的幼苗移栽水培,继续培养2个月后,进行100,200,300 mmol/L NaCl盐胁迫处理,以不加NaCl的Hoagland营养液为对照。每个处理设3个重复。在盐处理后第7天采集枸杞叶片,液氮处理后,保存于-80 ℃冰箱备用[13]。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA测序文库构建

采用天根生化科技有限公司(中国,北京)生产的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取宁夏枸杞叶片中的总RNA,构建cDNA测序文库。

1.2.2 Illumina HiSeq测序及差异基因筛选

通过高通量Illumina HiSeq PE150测序平台对已构建好的文库进行测序并获得原始数据。去除接头序列、过滤掉低质(low quality,碱基质量值小于等于25的碱基数占整个reads 60%以上)和N(N表示无法确定碱基信息)比例大于5%的reads,获得可用于后续分析的参考序列。将参考序列在Nr、Pfam、Swiss-prot、KEGG、GO数据库进行blastx比对获得基因功能注释。采用DESeq2进行基因的差异表达分析,以|log2(αFC)| >1,且P< 0.05作为标准筛选苯丙烷代谢途径相关的差异表达基因。

1.2.3 苯丙烷代谢途径相关基因qRT-PCR分析

为了进一步验证转录组数据的准确性,对苯丙烷代谢途径相关重要基因进行qRT-PCR分析。参考宁夏枸杞转录组测序结果,运用Primer Premier 5.0设计引物(表1),使用诺唯赞生物科技有限公司(中国,南京)生产的试剂盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02)进行荧光定量检测。PCR反应条件:预变性95 ℃孵育10 min,95 ℃变性30 s,60 ℃退火1 min,PCR循环数为40个,每个样品重复3次,采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。

表1 基因功能注释及引物序列

1.2.4 盐胁迫下宁夏枸杞苯丙烷代谢途径关键酶活性测定

采用苏州梦犀生物医药科技有限公司生产的试剂盒(中国,江苏)对宁夏枸杞叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸CoA羧化酶(4CL)、二氢黄酮还原酶(DFR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)的活性进行测定。

1.2.5 盐胁迫下宁夏枸杞抗氧化酶活性鉴定

采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒(中国,江苏)对宁夏枸杞叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性进行测定。

1.2.6 酚、类黄酮及木质素含量测定

采用苏州梦犀生物医药科技有限公司生产的试剂盒(中国,江苏)对宁夏枸杞叶片酚类、类黄酮和木质素含量进行测定。

1.3 数据处理

使用SPSS Statistics 26.0、Origin以及Excel对数据进行分析并作图。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对宁夏枸杞幼苗的生长形态的影响

宁夏枸杞生长形态在盐胁迫处理下发生明显变化(图1)。其中,随着NaCl浓度的增加,宁夏枸杞幼苗株高呈先增加后下降趋势,在100,200 mmol/L NaCl处理下明显高于对照组,在300 mmol/L NaCl处理下比对照组显著下降。同时,与0～200 mmol/L NaCl处理相比,宁夏枸杞幼苗在300 mmol/L NaCl处理下叶片数量减少,主根长度明显降低,叶片萎蔫,部分叶片脱落。以上结果表明,宁夏枸杞生长的最适盐浓度在100～200 mmol/L NaCl之间,300 mmol/L NaCl 明显抑制其生长。

Ⅰ～Ⅳ分别为 0,100,200,300 mmol/L NaCl处理。下同。

2.2 盐胁迫下宁夏枸杞苯丙烷代谢途径相关基因差异表达分析

通过KEGG Pathway 显著性富集分析对盐胁迫下宁夏枸杞叶片中所有差异表达基因进行分析,共有58个基因被显著富集于苯丙烷代谢途径(P< 0.05);与对照相比,100,200,300 mmol/L NaCl胁迫处理下宁夏枸杞叶片中分别有30,32,29个苯丙烷代谢相关基因差异表达,其中3个处理组共有显著差异表达基因7个(图2),进一步分析表明100 mmol/L NaCl处理组中上调基因20个,下调基因10个;200 mmol/L NaCl处理组中上调基因17个,下调基因15个;300 mmol/L NaCl处理组中上调基因11个,下调基因18个。本研究重点对苯丙烷代谢途径相关的15个关键基因的差异表达及其参与宁夏枸杞对盐胁迫的响应进行讨论(表2)。

图2 盐胁迫下宁夏枸杞叶片苯丙烷代谢途径相关差异表达基因

表2 盐胁迫下宁夏枸杞叶片苯丙烷代谢途径主要差异表达基因

2.3 盐胁迫下宁夏枸杞叶片苯丙烷代谢途径相关基因qRT-PCR分析

运用qRT-PCR对宁夏枸杞叶片中酚类、类黄酮和木质素合成相关的5个基因(PAL、C4H、4CL、CCoAOMT和POD12)在不同浓度盐胁迫下的表达模式进行分析。结果表明:随着盐浓度的增加,PAL表达量与对照相比均呈下降趋势,且差异均达到显著水平;C4H和4CL表达量呈先升后降的趋势,但C4H和4CL表达量分别以100 mmol/L和200 mmol/L最高,且均显著高于对照,其余处理均低于对照;POD12和CCoAOMT的表达量均随盐浓度的增加而先升后降,且各浓度处理均比对照显著上调,并均在200 mmol/L NaCl处理下表达量最高(图3,A)。

A. qRT-PCR分析; B. FPKM分析;数据以3次生物学重复的平均值±标准差表示。图中组间标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

进一步与转录组测序得到的FPKM值进行比较,发现上述5个基因在不同盐浓度下的表达水平和转录组测序的结果基本一致(图3,B),说明转录组测序结果可靠。

2.4 盐胁迫下宁夏枸杞叶片相关酶活性及酚、类黄酮和木质素含量分析

盐胁迫下宁夏枸杞叶片抗氧化酶活性测定结果(图4)显示,与对照组相比,叶片SOD和POD活性在各处理组均显著下调,但随着盐胁迫浓度升高,SOD活性逐渐上升,而POD活性逐渐下降,且处理间多差异显著;同时,叶片CAT活性在200 mmol/L NaCl处理下无显著变化,在100,300 mmol/L NaCl处理下均显著低于对照。

图4 盐胁迫下宁夏枸杞叶片SOD、POD和CAT活性变化

同时,对不同浓度盐胁迫下宁夏枸杞叶片苯丙烷代谢途径中相关酶的活性进行测定。结果(图5)显示,与对照组相比,叶片PAL和CAD活性在100 mmol/L NaCl处理下均显著上调,在200和300 mmol/L NaCl处理下均无显著变化;叶片C4H活性在各浓度NaCl处理下均与对照无显著差异,但100 mmol/L NaCl处理显著高于200 mmol/L NaCl处理,而与300 mmol/L NaCl处理无显著差异;叶片4CL和DFR活性均在100,200 mmol/L NaCl处理下均比对照显著上调,而在300 mmol/L NaCl处理下均无显著变化。

图5 盐胁迫下宁夏枸杞叶片PAL、C4H、4CL、DFR 和CAD活性变化

另外,对不同浓度盐胁迫下宁夏枸杞叶片中酚类物质、类黄酮和木质素的含量进行测定。结果 (图6) 显示,宁夏枸杞叶片中酚类物质含量在100,300 mmol/L NaCl处理下均显著高于对照,在200 mmol/L NaCl处理下显著低于对照;而叶片类黄酮的含量在各处理组均显著高于对照,并以100 mmol/L NaCl处理最高,且与其余处理差异显著;叶片木质素含量在100 mmol/L NaCl处理下达到8.56 mg/g,并显著高于对照,而在200和300 mmol/L NaCl处理下与对照组相比未发生显著变化。

图6 盐胁迫下宁夏枸杞叶片酚、类黄酮和木质素含量

3 讨 论

本研究通过KEGG pathway显著性富集分析发现100～300 mmol/L NaCl胁迫下宁夏枸杞叶片中共有58个苯丙烷代谢相关基因差异表达。该途径合成的酚类、类黄酮和木质素等在植物适应环境胁迫中扮演着重要的角色,酚类和类黄酮可通过清除ROS避免膜质过氧化从而减少环境胁迫对植物造成的损伤[14],而木质素可通过提高细胞壁的强度使植物适应环境胁迫[15]。

3.1 宁夏枸杞通过提高酚类和类黄酮含量清除过量ROS适应盐胁迫

酚类物质是重要的抗氧化物质[16],与植物耐盐性密切相关。盐胁迫下植物中PAL、C4H和4CL等基因的表达水平与酚类化合物积累相关[17-19]。本研究发现,宁夏枸杞叶片PAL基因表达量在盐胁迫下与对照相比显著下调,但PAL活性在100 mmol/L NaCl胁迫下显著上调,这可能是由于PAL属于多基因家族,不同物种中PAL基因种类和数目各有不同,因此对胁迫的响应也有所不同[20]。例如水稻中有8个PAL基因在盐胁迫下显著下调表达,而只有OsPAL3上调表达[21]。因此,宁夏枸杞中PAL家族可能也是由多个PAL基因构成的,所以在盐胁迫下的表达模式也不同,PAL活性的提高可能是由其他PAL基因控制的。C4H是细胞色素P450的一种,催化反式肉桂酸生成对香豆酸。盐胁迫下该基因的过表达有利于更多酚类物质的合成[22]。本研究中C4H表达量随NaCl浓度的增加呈现先升后降的变化趋势,与相应酶活性变化趋势一致,均在100 mmol/L NaCl处理下达到最高,该基因可能是促进宁夏枸杞叶片酚类物质积累的重要基因。4CL可以催化香豆酸和CoA合成香豆酰CoA。在烟草中过表达4CL提高了其酚类物质的含量及抗旱性[23]。本研究发现宁夏枸杞叶片中该基因转录水平在盐胁迫下呈先升后降的表达趋势,相应酶活性也在100,200 mmol/L NaCl胁迫下显著高于对照。值得注意的是,本研究中宁夏枸杞叶片酚类物质含量在100 mmol/L NaCl胁迫下显著高于对照。以上结果表明在适度盐胁迫下(100 mmol/L NaCl)宁夏枸杞可能通过调控苯丙烷代谢通路酚类合成关键酶基因的表达,积累酚类物质来清除过量ROS以适应盐胁迫。

类黄酮可作为植物体内二级抗氧化系统,当减少ROS产生的第一道防线抗氧化酶系统发生变化时,类黄酮的生物合成会被触发[24]。其通过提供电子或氢原子清除ROS[25],进而减少氧化胁迫对植物的伤害。在秋茄盐胁迫研究中发现CHS基因的表达有利于类黄酮物质的积累[10]。在植物中过表达CHS、F3H和F3′5′H、DFR显著提高了类黄酮的含量,增强了植物对盐、干旱和氧化胁迫的耐受性[26-30]。本研究发现在100 mmol/L NaCl胁迫下宁夏枸杞叶片中抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性均显著下调,表明此时它们清除ROS的能力下降;此时宁夏枸杞CHS、F3H、F3′5′H、DFR基因转录水平均呈上调表达的趋势,DFR活性也显著增加,类黄酮的含量明显升高,这一结果表明在适度盐胁迫下(100 mmol/L NaCl)宁夏枸杞叶片中的二级抗氧化系统类黄酮生物合成途径被激活,提高了其抗氧化胁迫的能力。而在中高度盐胁迫(200、300 mmol/L NaCl)下SOD和CAT的活性逐渐上调,类黄酮物质的含量相应减少,此时抗氧化酶系统和类黄酮物质一起协同清除ROS以适应盐胁迫。

3.2 宁夏枸杞通过木质素积累增加细胞壁强度适应盐胁迫

木质素是植物细胞次生壁的重要成分之一,在植物生长发育及抗逆性方面发挥重要作用[31],植物可通过调节细胞壁组分增加细胞壁强度来应对胁迫环境[32]。本研究发现在盐胁迫下宁夏枸杞叶片中与木质素合成相关的基因表达显著上调。CCoAOMT是木质素合成过程中的关键酶,参与木质素单体合成的甲基化反应,其基因表达水平与植物木质素含量密切相关[33]。逆境胁迫下该基因表达量的提高可能诱导木质素的迅速合成[34]。生姜CCoAOMT转录水平在中度NaCl胁迫下明显升高,但在较高NaCl浓度下降低,与其木质素含量变化趋势相同[35]。在本研究中,宁夏枸杞叶片中CCoAOMT基因也在100 mmol/L NaCl胁迫下显著上调,此时木质素含量明显上升,而随NaCl浓度的增加该基因表达及木质素含量与对照组相比未发生显著变化。CAD是催化各种肉桂醛生成木质素单体的关键酶。在非生物胁迫下CAD基因表达水平的增加可促进细胞壁木质化过程[36]。本研究发现盐胁迫下宁夏枸杞叶片中CAD基因下调表达,但其酶活性在100 mmol/L NaCl处理下显著上调,而且木质素含量较对照显著升高。这可能是由于盐胁迫导致基因发生翻译后蛋白修饰,使酶活性与基因表达量不同步[37]。表明宁夏枸杞可能通过木质素合成途径中关键基因差异表达以及酶蛋白翻译后修饰等多种调控方式应答盐胁迫。

综上所述,在100 mmol/L适度盐胁迫下,宁夏枸杞通过调控苯丙烷代谢途径中相关基因的表达来增加酚类物质、类黄酮和木质素等次生代谢物质的积累,从而启动非酶促抗氧化系统减缓ROS造成的伤害,并通过合成木质素增加细胞壁强度来协同适应盐胁迫,这可能是宁夏枸杞适应盐胁迫环境的一种重要特征。但在200,300 mmol/L的中高度盐胁迫下,以上3类化合物的合成均明显减弱,植株耐盐性降低和生长受到抑制,因此认为宁夏枸杞生长最适盐浓度在100～200 mmol/L NaCl之间,这与盐胁迫下宁夏枸杞生长形态变化相一致。本研究结果为阐明苯丙烷代谢途径相关基因、酶以及产物参与提高宁夏枸杞耐盐性提供了理论依据,同时对宁夏枸杞的栽培生产具有重要指导意义。