亚砷酸钠对人肝星状细胞的激活作用及其与铁死亡的关系

迪丽娜尔·亚尔麦麦提，黄菲，丁关鑫，赵丽君，吴顺华

1 新疆医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，乌鲁木齐830011；2 新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室

肝纤维化是由自身免疫性疾病、代谢性疾病或全身性疾病、病毒、药物或毒性化学物质损害引起的慢性弥漫性疾病［1］。肝星状细胞持续激活是肝纤维化发生发展的关键环节。在正常肝脏中，肝星状细胞处于静止状态；当肝脏受到刺激发生损伤时，肝星状细胞被激活，可发生形态上的改变，并迁移到损伤部位，同时分泌大量细胞外基质和促炎、促纤维化细胞因子，促进肝纤维化发生发展［2］。无机砷为Ⅰ类致癌物，长期摄入无机砷可引起肝纤维化甚至肝癌。研究发现，在无机砷引起肝纤维化的过程中，活性氧（ROS）水平升高［3］，表明ROS参与了无机砷致肝损伤作用。铁死亡是铁依赖性脂质ROS大量堆积引起的新型细胞死亡方式［4］。铁死亡的本质是谷胱甘肽（GSH）耗竭，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性下降，不能及时分解脂质ROS，导致脂质ROS大量堆积，从而破坏细胞膜的完整性，导致细胞死亡［5］。研究表明，铁死亡与肝纤维化、肝癌、肝缺血再灌注损伤等疾病密切相关［6-8］。但铁死亡是否参与无机砷致肝纤维化的研究鲜有报道。2020年12月—2023年2月，我们通过观察亚砷酸钠（NaAsO2）对肝星状细胞的激活作用，从铁死亡的角度探讨无机砷致肝纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 人肝星状细胞LX-2（武汉普诺赛生命科技有限公司）。NaAsO2（北京化学试剂三厂），高糖培养基DMEM、PBS、胰酶、胎牛血清（美国Gibco公司），GSH检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量试剂盒、BODIPY 581/591 C11探针（美国Thermo Fisher Scientific公司），总RNA抽提试剂盒（美国Omega Bio-tek公司），PCR逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒（日本Takara公司）。倒置显微镜（美国LEICA）；CO2培养箱、酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），低温离心机（美国Sigma公司）。

1.2 细胞培养 取LX-2细胞，加入含12%胎牛血清、1%青霉素—链霉素的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每隔24 h换液1次。待细胞融合度达到80%时，加入胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀。按1∶3传代培养，收集对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 细胞分组与干预方法 取对数生长期细胞，接种于6孔板。将细胞随机分为NaAsO2组和对照组，NaAsO2组分别加入5、10、15 μmol/L NaAsO2，对照组加入DMEM培养基，继续培养24 h。

1.4 细胞激活形态观察 吸弃各组细胞培养液，收集细胞，PBS清洗；加入1 mL PBS，置于倒置显微镜下拍照，观察细胞形态。

1.5 细胞GSH检测 收集各组细胞，加入PBS，超声破碎细胞并混匀。取0.1 mL细胞悬液置于1.5 mL离心管中，加入100 μL检测试剂混匀，3 500 r/min离心10 min，取上清。按试剂盒说明配置空白格、标准管、测定管，从各管吸取0.25 mL反应液于96孔板，轻微震荡孔板混匀，静置5 min，于405 nm处酶标仪测定各孔吸光度值。实验独立重复3次。GSH含量=［OD（实验）－OD（空白）］/［OD（标准）－OD（空白）］×C标准×稀释倍数/蛋白浓度。

1.6 细胞脂质ROS检测 收集各组细胞，Hank's平衡盐溶液清洗。加入500 μL含10 μmol/L BODIPY 581/591 C11分子探针工作液，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗余留的分子探针3次。加入Hoechest 33342探针复染细胞核5 min，吸弃染色液，加入PBS清洗2次。加入500 μL基础培养基，立即使用共聚焦显微镜进行观察并拍照。蓝色荧光表示细胞核；绿色荧光（488 Ex/510 Em）表示细胞脂质氧化性能，即脂质ROS荧光强度；红色荧光（581 Ex/591 Em）表示细胞抗氧化性能。

1.7 细胞纤维化基因和铁死亡基因检测 采用RT-PCR法检测纤维化基因α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）和铁死亡基因溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、GPX4。收集各组细胞，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。引物设计由上海生工股份有限公司完成，引物序列见表1。根据实时荧光定量PCR试剂盒说明建立反应体系。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1 细胞纤维化、铁死亡及内参基因PCR引物序列

1.8 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，呈正态分布的数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。相关性分析采用Spearman相关法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞形态比较 对照组细胞生长状态良好，细胞形态饱和，具有往外延伸的触角，呈星状，细胞抱团生长。NaAsO2组加入不同浓度NaAsO2后，细胞数量显著下降，同时细胞形态发生改变。其中加入5 μmol/L NaAsO2后仍可观察到往外延伸的触角，细胞形态较完整，细胞团间距变大；加入10 μmol/L NaAsO2后细胞触角开始回缩，细胞数量显著减少；加入15 μmol/L NaAsO2后大部分细胞触角明显回缩甚至消失，大部分细胞形态呈圆形且有细胞皱缩和破裂现象，细胞间隙变宽。见OSID码图1。

2.2 各组GSH含量比较 对照组、5、10、15 μmol/L NaAsO2组GSH含量分别为20.95 ± 1.60、16.67 ±2.26、14.66 ± 1.43、10.55 ± 1.03。与对照组比较，NaAsO2不同浓度组细胞GSH含量均减少，其中15 μmol/L NaAsO2组GSH含量低于10、5 μmol/L NaAsO2组，10 μmol/L NaAsO2组低于5 μmol/L NaAsO2组（P均＜0.05）。

2.3 各组脂质ROS比较 对照组无明显绿色荧光，红色荧光较强；5 μmol/L NaAsO2组可见少量颗粒状绿色荧光；10 μmol/L NaAsO2组绿色荧光较5 μmol/L组有所增强；15 μmol/L NaAsO2组绿色荧光明显增强，红色荧光明显减弱。见OSID码图2。

2.4 各组细胞α-SMA、CollagenⅠ mRNA表达水平比较 与对照组比较，NaAsO2组α-SMA、CollagenⅠmRNA表达水平均升高；其中15 μmol/L NaAsO2组高于10、5 μmol/L NaAsO2组，10 μmol/L NaAsO2组高于5 μmol/L NaAsO2组（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组α-SMA、CollagenI mRNA表达水平比较（）

表2 各组α-SMA、CollagenI mRNA表达水平比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与5 μmol/L NaAsO2组比较，bP＜0.05；与10 μmol/L NaAsO2组比较，cP＜0.05。

α-SMA mRNA CollagenⅠ mRNA 2.13 ± 0.28a 4.52 ± 0.28ab 9.56 ± 0.79abc 1.00 ± 0.04组别NaAsO2组5 μmol/L 10 μmol/L 15 μmol/L对照组2.10 ± 0.20a 3.01 ± 0.14ab 6.48 ± 0.29abc 1.00 ± 0.06

2.5 各组细胞SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平比较 与对照组比较，NaAsO2组SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平均降低；其中，15 μmol/L NaAsO2组SLC7A11 mRNA表达水平低于10、5 μmol/L NaAsO2组，10 μmol/L NaAsO2组SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平低于5 μmol/L NaAsO2组（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平比较（）

表3 各组SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与5 μmol/L NaAsO2组比较，bP＜0.05；与10 μmol/L NaAsO2组比较，cP＜0.05。

SLC7A11 mRNA GPX4 mRNA 0.74 ± 0.07a 0.45 ± 0.01ab 0.67 ± 0.04ac 1.00 ± 0.07组别NaAsO2组5 μmol/L 10 μmol/L 15 μmol/L对照组0.52 ± 0.04a 0.27 ± 0.01ab 0.11 ± 0.01abc 1.00 ± 0.04

2.6 细胞铁死亡基因与肝纤维化基因的相关性α-SMA mRNA与CollagenⅠ mRNA均呈正相关（r分别为0.95，P＜0.01）。α-SMA mRNA与GPX4、SLC7A11 mRNA表达均呈负相关（r分别为-0.72、-0.92，P均＜0.001），CollagenⅠ mRNA与GPX4、SLC7A11 mRNA表达亦呈负相关（r分别为-0.67、-0.90，P均＜0.001）。

3 讨论

肝星状细胞激活是肝脏代谢功能障碍的关键因素。在正常肝脏中，肝星状细胞位于肝细胞的基底外侧表面和窦内皮细胞之间的Disse空间中，储存维生素A并长期处于静止状态。肝星状细胞通过触角与内皮细胞直接接触，与周围细胞相互作用影响细胞分化、迁移、增殖以及存活等各种细胞功能。当肝脏受到刺激时，导致类维生素A和脂滴的丢失；肝星状细胞在形态上从“饱满”状变为扁平外观，并迁移到肝损伤部位，同时分泌大量ECM和多种促炎和促纤维化细胞因子，促进肝纤维化发生与发展［9］。砷是自然界中200多种矿物质的主要成分，岩石及矿物风化和溶解、地热流体以及火山活动等自然因素以及使用含砷肥料和农药、排放工业含砷污染水、开采煤炭等人为因素均可引起环境砷污染，对人类健康产生潜在危害。当砷通过呼吸系统、消化系统或皮肤进入人体后，可以模仿磷酸盐、葡萄糖和甘油等矿物质和营养物质的底物，通过营养物质转运蛋白通道进入细胞内［10］。研究显示，砷中毒患者肝脏B超检查可见细密光点，肝回声增强且不均匀，严重者可出现肝硬化、腹水等征象［11］。本研究结果显示，加入不同浓度NaAsO2后，LX-2细胞数量显著减少，同时细胞形态发生改变，从星状逐渐回缩为圆形，细胞间隙逐渐变宽，甚至出现细胞破裂现象，表明Na-AsO2对肝星状细胞具有毒性作用。

无机砷可导致细胞ROS堆积，打破氧化还原平衡，引起肝脏氧化应激反应。研究表明，细胞线粒体损伤、内质网应激、消耗细胞抗氧化剂均可导致细胞ROS积累，引起肝损伤。GSH是抗氧化应激的关键物质，参与ROS清除DNA合成以及信号转导等多种生物活动，保护细胞膜的作用。当抑制GSH的生物合成或阻断细胞从外环境获取胱氨酸，导致细胞GSH耗竭引起ROS堆积［12］。本研究发现，加入不同浓度NaAsO2后，LX-2细胞GSH含量减少，提示NaAsO2致LX-2细胞抗氧化能力下降。

砷致肝损伤过程中ROS水平升高。研究发现，砷暴露可引起p53依赖性ROS积累，线粒体膜电位损伤，引起肝细胞凋亡［13］。阻断细胞内ROS的积累是研究重点与难点。研究发现，暴露于无机砷致肺上皮细胞铁蛋白表达量升高，GPX4表达水平下降并通过线粒体ROS介导内质网膜功能障碍进而诱导铁死亡引起急性肺损伤［14］。本研究结果显示，对照组细胞未检测到颗粒状脂质ROS荧光，加入不同浓度NaAsO2后，随着NaAsO2浓度升高，细胞脂质ROS荧光强度逐渐增强。因此NaAsO2引起LX-2细胞GSH减少导致脂质ROS不能及时分解而积累，这可能与细胞膜破坏有关。

SLC7A11作为铁死亡的重要指标，负责将胱氨酸运输至细胞内，其被还原为半胱氨酸，用于合成细胞内主要的抗氧化剂GSH。GSH是谷胱甘肽过氧化物酶GPX4的一个必要辅因子，有助于GPX4还原脂质过氧化物为无毒脂质醇，调节细胞内氧化还原状态，发挥保护细胞膜结构及功能的作用［15］。用含砷中药雄黄连续灌胃小鼠28 d造成肾毒性，并伴有铁蓄积和ROS增加，SLC7A11、GPX4表达水平降低，且雄黄以剂量依赖性的方式引起肾脏组织铁死亡［16］。本研究结果显示，与对照组比较，NaAsO2组SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平均降低，其中高浓度组表达水平低于低浓度组，提示NaAsO2可下调LX-2细胞SLC7A11、GPX4 mRNA表达，这可能导致脂质ROS堆积，引起细胞损伤。

当肝脏持续受到外界刺激时，处于静态的肝星状细胞不断被激活，促使a-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ等纤维化指标表达，细胞外基质分泌增加，改变肝脏组织结构，引起肝纤维化。吴顺华等［17］研究发现，NaAsO2导致大鼠纤维化指标α-SMA、CollagenⅠ表达量升高，引起大鼠肝星状细胞激活。李昂等［18］报道，NaAsO2可抑制LX-2细胞增殖，促进α-SMA表达升高。本研究结果显示，与对照组比较，NaAsO2组α-SMA、CollagenⅠ mRNA表达水平均升高，其中高浓度组表达水平高于低浓度组，提示NaAsO2可上调LX-2细胞纤维化指标，从而引起细胞激活。

为了明确铁死亡基因与纤维化基因之间的相关性，我们进一步对铁死亡指标GSLC7A11、GPX4和纤维化指标α-SMA、CollagenⅠ进行相关性分析，结果显示纤维化指标与铁死亡指标存在负相关。这提示NaAsO2可能通过调控SLC7A11-GSH-GPX4轴上的铁死亡相关基因而引起肝星状细胞纤维化指标表达升高。

综上所述，NaAsO2可致肝星状细胞激活，促进其纤维化基因表达；在此过程中，NaAsO2通过下调细胞SLC7A11、GPX4基因表达，引起ROS堆积，促进细胞铁死亡。因此，靶向铁死亡可能成为防治砷中毒致肝纤维化的新方向。