归芍八味汤对缺血性卒中后抑郁模型大鼠行为学及神经功能的影响*

聂 皎,高俊峰,杨锦湄,高雪娟,李 青,李灯彩

(1.云南中医药大学第三附属医院老年病科,云南 昆明 650050; 2.云南中医药大学,云南 昆明 650050)

近年来,我国脑卒中患者不断增加,目前患病人数居世界首位,发病人数每年达150万～200万,中青年患者的复发率较高,其并发症也在逐年递增,70%的患者存在不同程度的功能障碍,已经成为我国公共卫生的主要问题[1-2]。脑卒中后可能出现诸多并发症,其中卒中后抑郁(post stroke depression,PSD)是比较常见且严重的并发症之一,可发生于卒中后的各个阶段。研究报道,卒中后2年之内PSD的发病率较高,卒中后2周内发病率最高,此阶段的总体发病率为25%～60%,严重影响疾病的预后[3]。PSD的常见临床表现包括情绪低落、兴趣减退、思维迟缓、睡眠障碍、悲观失望,甚至绝望自杀等,会导致康复有效率降低、神经缺损功能难以恢复而使致残率、病死率升高[4]。本研究观察归芍八味汤对缺血性卒中后抑郁大鼠行为学及神经功能的影响,探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

雄性SD大鼠80只,体质量250～300 g,由昆明医科大学提供,实验动物生产许可证编号为SCXK(滇)K2020-004。购入后适应性喂养1周,采用Open-field法[5]选取实验大鼠,结果有10只大鼠不符合条件被剔除,进入实验70只。本研究完成后,对大鼠的处理严格按照我国《关于善待实验动物的指导性意见》中规定执行,并且经云南中医药大学医学动物伦理审查委员会审查批准。

1.2 药品、试剂与仪器

归芍八味汤处方组成:当归、白芍、石菖蒲、郁金各15 g,柴胡、琥珀各10 g、水蛭5 g、甘草片6 g。选用配方颗粒,由昆明市中医医院制剂室制成质量分数1 g/mL的药液。盐酸氟西汀胶囊,礼来苏州制药有限公司产品,批号J20170022,20 mg/粒。大鼠用量按60 kg成年人的日用量20 mg的7倍计算,为2.3 μg/(g·d),溶于蒸馏水中,溶液质量分数为0.23 g/L。敞箱试验箱,100 cm×100 cm×40 cm黑色塑料箱,上海欣软信息科技有限公司产品;XR-XM101型Morris水迷宫箱,直径160 cm、高50 cm的圆形水池,湖南百众生物科技有限公司产品。

1.3 动物分组

考虑到脑缺血造模大鼠死亡率高,选取60只大鼠,分为假手术组12只和模型组48只。

1.4 模型的建立

1.4.1 脑缺血大鼠模型的建立

参照参考文献[6],采用大脑中动脉局灶性线栓法建立脑缺血大鼠模型,大鼠清醒2 h后评估神经功能,1～3分入组。术后腹腔注射 80 000 U 青霉素3 d以预防感染。假手术组动物除不插入线栓外,其他过程同模型组。

1.4.2 脑卒中后抑郁大鼠模型的建立

脑缺血手术第2天,将假手术组大鼠放置于另一个房间,每4～5只饲养在同一笼内,除应激第1、15、21天与模型组同时禁水、次日进行蔗糖消耗实验[7]外,其余时间正常摄食、饮水,不给予任何刺激。其余大鼠单笼喂养,并接受慢性不可预知温和应激 (CUMS)刺激21 d。大鼠在3周内安排以下7种应激方法,每天随机选取1种,1周内每种选用1次,共3周。应激刺激实验日程表如下:3次21 h禁水进食、3次声电刺激(电压0.9 mA,声电刺激循环8次/只)、3次昼夜颠倒、3次倾斜鼠笼(鼠笼倾斜成45 °,持续24 h)、3次恒温烘箱热烘5 min、3次夹尾1 min、3次30 min水平摇晃(160次/min,持续5 min)。

造模过程中7只大鼠死亡,最终造模成功41只。随机选取36只大鼠,分为模型组、归芍八味汤组和盐酸氟西汀组,每组12只。

1.5 给药方法

归芍八味汤组灌胃归芍八味汤5.25 g/kg体质量(按每天汤剂临床用量生药含量0.75 g/kg的7倍计算),氟西汀组灌胃氟西汀溶液2.3 μg/g体质量,假手术组及模型组给予生理盐水2 mL灌胃。均1次/d,持续6周。

1.6 检测指标与方法

均于模型建立后第1次(应激第22天)和最后1次给药结束(治疗第42天)进行。

1.6.1 大鼠的行为学测评

①蔗糖水消耗量:考察大鼠对奖赏的反应。计算每组动物饮用质量分数10 g/L蔗糖水1 h后的蔗糖水摄入量。②敞箱实验:以水平活动反映大鼠的运动活动情况,以垂直活动反映兴趣状态。用线条将盒子的底部分成25个相等的正方形。以大鼠穿过方块的数量作为水平活动的得分,用直立次数作为垂直活动得分。每只大鼠测试1次,每次3 min。③水迷宫实验:测试大鼠的学习记忆能力。将水迷宫分为4个象限,第三象限有一个平台区,每个象限至平台区为一个阶段的训练。实验分2 d进行。第一天,训练第一象限至终点3次、第二象限至终点3次、第三象限至终点3次、第四象限至终点3次。训练时间每次限制在3 min内,若超时也按3 min计。完成训练后,测定从第四象限到第三象限的时间及入平台区的次数。第二天,测定从第四象限到终点的时间及入平台区的次数。

1.6.2 神经行为学评分

评分标准按6级评价方法[8]进行改进。0分:无功能障碍。1分:可以伸展前肢。2分:向一侧旋转。3分:向一侧倾倒。4分:无自主活动,意识受抑制。5分:死亡。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠蔗糖水消耗量对比

应激第22天,与同期假手术组对比,归芍八味汤组、盐酸氟西汀组和模型组的蔗糖水消耗量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗第42天,归芍八味汤组、盐酸氟西汀组蔗糖水消耗量均较同期模型组、同组应激第22天升高,差异有统计学意义(P<0.05);归芍八味汤组较盐酸氟西汀组蔗糖水消耗量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠蔗糖水消耗量对比

2.2 各组大鼠敞箱实验结果对比

应激第22天,与同期假手术组对比,归芍八味汤组、盐酸氟西汀组和模型组的水平活动和垂直活动得分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗第42天,归芍八味汤组、盐酸氟西汀组水平活动和垂直活动得分均较同期模型组、同组应激第22天升高,差异有统计学意义(P<0.05);归芍八味汤组与盐酸氟西汀组水平活动和垂直活动得分差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠敞箱实验结果对比 次,

2.3 各组大鼠水迷宫实验结果对比

应激第22天,与同期假手术组对比,归芍八味汤组、盐酸氟西汀组和模型组的学习能力和记忆能力得分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗第42天,归芍八味汤组、盐酸氟西汀组学习能力得分较同期模型组提高,两组的学习能力和记忆能力得分较同组应激第22天提高,差异均有统计学意义(P<0.05);归芍八味汤组与盐酸氟西汀组学习能力和记忆能力得分对比,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠水迷宫实验结果对比

2.4 各组大鼠神经行为学评分

应激第22天,与同期假手术组对比,归芍八味汤组、盐酸氟西汀组和模型组的神经行为学评分升高,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗第42天,归芍八味汤组、盐酸氟西汀组神经行为学评分较同期模型组、同组应激第22天均降低,差异有统计学意义(P<0.05);归芍八味汤组较盐酸氟西汀组神经行为学评分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠神经行为学评分对比 分,

3 讨 论

PSD的发病机制复杂,并非单一机制所能解释。就目前而言,大部分研究者认为其发病符合生物-心理-社会医学模式。关于PSD的发病机制假说很多。Haneda等[9]认为,脑卒中后抑郁的发展与脑损伤引起的神经生物学变化有关。这些神经生物学改变主要包括解剖学部位、神经递质、神经内分泌、神经营养因子及中枢神经可塑性改变等。研究表明,海马神经可塑性改变与PSD的发生密切相关[10],主要表现在以下两个方面:第一,对抑郁患者进行尸检时发现,其脑组织内海马的体积下降,并伴神经细胞萎缩和缺失[11];第二,抗抑郁药治疗可保护海马萎缩,促进海马的神经再生,且阻断海马神经再生可使绝大多数抗抑郁药失效[12]。细胞凋亡是中枢神经可塑性改变的一个重要环节。脑梗死后的神经细胞死亡以凋亡为主,细胞凋亡的区域包括缺血侧海马及大脑皮层等部位[13]。海马属于边缘系统的一部分,是与人类的学习、记忆及情感等高级认知功能密切相关的结构,也是应激损伤的主要靶器官。应激可导致海马神经元凋亡增多,这可能是诱发抑郁症的器质性基础[14]。药物治疗可通过抗凋亡作用对缺血脑组织起保护作用[15-16]。

中医学认为,PSD属“郁证”范畴,发病与中风后经络不通、脏腑阴阳失衡有关。现代医家大多认为,该病的病因病机是中风后气机倒转,痰瘀内生,阴阳受损,使清窍失养、精神损失;认为该病病位在脑,与肝、心、脾和肾有关。《灵枢·本神篇》曰:“所以任物者谓之心。”又曰:“心藏脉,脉舍神。”还曰:“肝藏血,血舍魂”。魂魄意志是中医学对人体身心状态的概括和推导。《灵枢·本神篇》中的“随神往来者谓之魂”,实际上是指人们随着思想和精神而变化的思维和意识活动。人的精神意识活动受五脏六腑的作用调节,以心为主导,肝脏理气,行气活血,调节精神和情绪,保持五脏六腑和全身经络的协调。反之,若神动而魂不应或魂动神不知则为病态,表现为表情淡漠、少动,或狂躁不安,或伴有失眠健忘,或伴有轻微的痛苦和哭泣,或出现嗜睡、恍惚、幻觉等神经精神症状。因此,病生于心,责之于肝,为形神俱病,以神为主。肝阴血不足,其特点是魂不守舍,故治宜心肝并治、神魂兼调。在此基础上,笔者研制了归芍八味汤。方中柴胡疏肝解郁,为君药;郁金、石菖蒲行气解郁,琥珀安神,当归、白芍养血柔肝及平和阴阳,共为臣药;水蛭活血化瘀,为佐药;炙甘草调和诸药,为使药。诸药合用,共奏行气解郁、养血柔肝、重镇安神之功。现代药理学研究表明:柴胡、白芍、石菖蒲具有保护神经元和抑制神经细胞凋亡的作用[17-19]。柴胡有良好的抗抑郁作用,其主要与保护神经元和抑制海马神经元的凋亡有关[20-21];郁金对异常的大脑神经元具有一定的抑制作用[22];琥珀中的琥珀酸具有中枢抑制作用;水蛭可抑制凝血酶的产生和凝血酶活性[23];当归具有镇静、神经保护及神经修复作用,对卒中后抑郁大鼠有一定的治疗作用[24];炙甘草药理作用广泛,被广泛应用于抗抑郁的中药处方中[25]。

本研究结果显示:归芍八味汤干预后,PSD大鼠对蔗糖水的消耗量较其他组明显增加(P<0.05),提示归芍八味汤可提高大鼠对刺激性奖赏的兴趣。在敞箱实验和水迷宫测试中,归芍八味汤组较模型组移动距离及速度明显增加(P<0.05),提示归芍八味汤可提高模型大鼠对外界的探索活动,故可有效改善模型大鼠的抑郁症状。神经功能评分方面(P<0.05),提示归芍八味汤可提高大鼠神经行为学评分,即可促进PSD大鼠神经功能的恢复。

综上所述,归芍八味汤心肝同调、形神并治,具有养血活血、解郁安神之效,其组方可改善大鼠的抑郁症状,增加其对外界活动的探索及兴趣,在一定程度上可提高PSD大鼠的学习能力及记忆能力,明显提高卒中后大鼠的神经行为学评分。归芍八味汤促进大鼠神经功能恢复的具体机制可能与抑制神经元凋亡、改变中枢神经可塑性有关,但关于其作用的信号通路或介导的炎症反应及参与的细胞因子,仍待进一步的实验研究。