安徽六安地区1例鹅圆环病毒病PCR诊断与分析

胡晓苗,杨 雪,戴 银*,潘孝成,王红燕,赵瑞宏,周学利,侯宏艳,沈学怀,尹 磊,殷冬冬,鲁春燕

(1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所/安徽省畜禽疫病研究中心/畜禽产品安全工程安徽省重点实验室,安徽合肥 230031;2.宣城市动物防疫站,安徽宣城 242000)

鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)属于圆环病毒科圆环病毒属,鹅感染GoCV后,主要表现为免疫力低下、腹泻、生长发育缓慢、羽毛凌乱、消瘦、精神沉郁等非特异性临床症状,严重时会出现羽毛脱落和羽毛囊坏死现象[1]。通常情况下,鹅感染圆环病毒时多为隐形感染,感染率高但发病率、死亡率很低,往往混合感染其他病原时才被检出。

鹅圆环病毒首次由德国学者Soike等[1]发现,随后Todd等最先完成GoCV全基因组测序分析[2]。2003年中国台湾省发现鹅圆环病毒[3],余旭平等[4]在浙江永康朗德鹅中发现了鹅圆环病毒。2006年英国学者Scott等[5]利用荧光抗体检测方法对匈牙利的一些鹅场进行GoCV血清学调查,结果发现GoCV在匈牙利鹅场普遍存在。PCR方法是GoCV常用的检测方法,2007年杨晓伟等[6]应用PCR方法在重庆市某鹅场检测到鹅圆环病毒;2010年万春和等[7]应用PCR方法在江西省朗德鹅中检测到GoCV;2015年张敏等[8]应用PCR方法从山东潍坊朗德鹅体内检测到GoCV,曹慧慧等[9]对广西GoCV流行毒株的全基因组进行了测序、结果表明,广西流行毒株与部分浙江分离毒株在亲缘关系上比较接近,2017年刘玲凤[10]对广东水禽GoCV感染情况进行了调查,并对GoCV全基因组序列进行了分析;2018年吴方达[11]在福建地区一例生长消瘦鹅中PCR检测到GoCV感染,获取了GoCV福建株基因组全长序列;2021年沈文浩[12]对安徽部分地区GoCV感染情况进行了调查,并对其进行了遗传进化分析。

2022年11月中旬,安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医临床指导中心接诊了六安市某朗德鹅场送来的5只病死鹅,46日龄。通过观察临床症状和病理变化,初步判断为鹅圆环病毒感染。为了进一步确诊,根据GenBank上已发表的鹅圆环病毒序列,设计了1对特异性引物,对发病鹅组织器官进行鹅圆环病毒PCR检测,扩增到1株鹅圆环病毒(命名为AHLA39),并进行序列测定和分析。

1 临床症状与病理变化

1.1 临床症状较为普遍的现象是病鹅消瘦、羽毛凌乱,背部羽毛脱落,毛孔出血;精神不振,腹泻;鹅群采食不佳,饲料采食偏少,偏好采食青饲料(图1)。

图1 背部羽毛脱落、出血

1.2 病理变化病理解剖症状为肝脏肿大、出血;肠道出血,有大量脓性炎症产物;心包积液,心内膜少量出血(图2、3)。

图2 肝脏出血、心包积液

图3 肠道出血

2 材料与方法

2.1 病料样品无菌采集六安地区某养殖场发病鹅肝脏、脾脏和肾脏。

2.2 方法

2.2.1引物的设计与合成。从GenBank下载鹅圆环病毒序列,根据GenBank已经上传的序列进行比对,确定上述病毒的保守区域,利用引物设计软件设计检测引物F:5′-ACCCTACCTTTGAAGATT-3′,R:5′-CAACCATAAAAGTCGTCC-3′,扩增片段大小580 bp。

2.2.2DNA的提取。将病料组织剪碎,按1∶10的比例加入灭菌PBS,放入碾钵碾碎,反复冻融3次,室温12 000 r/min离心5 min,取上清备用。按照提取试剂盒说明书提取DNA,-80 ℃保存备用。

2.2.3PCR的反应体系。总反应体系25 μL:2×Taqplus Master Mix 12.5 μL,DNA模板3.0 μL,上游引物(F)1.0 μL,下游引物(R)1.0 μL,ddH2O 7.5 μL。反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延90 s,扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。扩增完成后,取上述PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,阳性PCR产物送上海生工生物有限公司测序。

3 PCR检测结果

3.1 目的条带PCR扩增获得的条带是580 bp,大小与预期相符,确诊为鹅圆环病毒感染。具体结果见图4。

注:M.2 000分子量Marker;1.阳性对照;2、3.阳性样品;4.阴性对照。

3.2 遗传进化分析使用MEGA 7.0将测序所得片段进行整理拼接好,并与GenBank参考株进行比对及构建进化树(图5),使用MegAlign进行遗传进化分析。

图5 鹅圆环病毒遗传进化分析

4 讨论

(1)利用MegAlign软件对鉴定毒株与其他GoCV毒株进行遗传进化分析。感染毒株与山东分离株KT387277.1的遗传距离最近,与浙江分离株yk3(DQ192280.1)、yk1(AY633653.1)以及广东分离株MT831935.1、MT831939.1遗传距离也比较近,与鸭源圆环病毒(DuCV)的遗传距离较远。

(2)鹅圆环病毒常潜伏侵染鹅淋巴器官,引起免疫力下降[13],导致鹅常发生混合感染,病情加重,单纯使用鹅圆环病毒抗体治疗,效果不佳。因此,该病毒的感染直接或间接对鹅养殖业造成巨大的经济损失,是一种高感染率的免疫抑制病,应引起各养殖户的高度关注。

(3)安徽省六安市养鹅产业比较发达,皖西白鹅、朗德鹅等品种鹅饲养量大,鹅苗来源复杂,该病的防控显得尤为重要。今后将持续开展该病毒的分子流行病学调查,关注该病毒的流行情况,加强后续研究,争取为该病毒的防治提供较为可行方案。