4 ℃丙酮液固定剂对肾穿刺活检组织免疫荧光染色的效果观察

王伟力

肾脏疾病的治疗方案与临床精准诊断和分型有关，而临床表现和实验室检查常无法做出明确诊断，需要依靠病理检查作为“金标准”进行最终判定[1]。肾穿刺直接免疫荧光染色是肾脏疾病病理检查的基本手段之一[2]。固定剂的选择对免疫荧光染色效果会造成较大的影响[3]，若固定剂选择不适宜，则会导致组织破坏及边缘结构不清晰，对免疫荧光染色产生很大影响，如假阳性率高及定位不准确，严重影响送检标本的临床病理诊断[4]。因此，充分固定和固定剂的选择至关重要。为了更好地了解固定剂的选择对直接免疫荧光染色效果的影响，本文比较和分析了三种不同固定剂对诊断为IgA肾病的肾脏穿刺组织的直接免疫荧光染色质量，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2022 年1—12 月湖州市第一人民医院肾内科送检以及外院送检的112 例肾脏穿刺活检组织标本，分别采用4%中性甲醛液固定剂（实验组1）、丙酮液固定剂（实验组2）及4 ℃丙酮液固定剂（实验组3）固定，三种不同固定剂对同一肾穿刺组织进行固定处理并比较染色效果。其中将58例后期诊断为IgA 肾病的荧光染色效果纳入统计。本研究经湖州市第一人民医院医学科研与临床试验伦理委员会审批通过。

1.2 方法 将新鲜肾穿刺标本置于玻片上，在显微镜下准确观察，确定标本是否含有肾小球，将有肾小球的标本用0.9%氯化钠注射液浸湿的纱布盛装。免疫荧光直接法染色：将新鲜的肾穿刺组织置于冻头，放入冷冻机，待标本冷冻后，将标本以4m 的厚度切取35 ～40 张，用免疫载玻片贴附后进行免疫荧光直接法染色。首先将冷冻切片各9 张放入实验组1、实验组2 和实验组3 中，在暗室固定20 min，分别放入PBS 浸润洗涤3 次，每次3 min，在切片背面用黑色记号笔围绕组织划圈，便于镜检时快速找到组织位置；擦除组织周围的PBS 缓冲液，分别滴加兔抗人荧光素抗体IgA、C3（稀释比均为1∶25）；将切片置于湿盒内，置于25 ℃温箱中避光孵育60 min；用PBS 浸润洗涤3 次，每次5 min，甩干除去多余PBS缓冲液，用缓冲甘油封片，最后在荧光显微镜下观察并拍照[5]。

1.3 免疫荧光标记评价标准 切片置于荧光显微镜下，由肾脏病理诊断医师观察肾小球IgA和C3 荧光附着部位及亮度（IgA 和C3 为IgA 肾病病理诊断的关键标志）。IgA 和C3 阳性部位应表达于肾小球系膜区和毛细血管壁，呈团块状或颗粒状亮点沉积。强度为6 级：未见为（—），高倍镜下隐约可见为（±），高倍镜下可见为（＋），高倍镜下清晰可见为（2 ＋），高倍镜下耀眼为（3 ＋），高倍镜下刺眼为（4 ＋）[6]。本研究将免疫荧光显色强度（—）、（±）、（＋）归为低表达组，将免疫荧光显色强度（2 ＋）、（3 ＋）、（4 ＋）归为高表达组，两组进行比较。

1.4 统计方法 采用SPSS 26.0 统计软件进行分析，计数资料采用2检验，P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

在荧光显微镜下观察，两种抗原标记物在3 组实验中的表达差异均有统计学意义（均P ＜0.05），见表1。4 ℃丙酮液固定染色效果最好，IgA、C3 呈团块状沉积于肾小球系膜区，强度为（3 ＋），无背景着色；常温丙酮固定液染色效果较好，IgA、C3 沉积于肾小球系膜区，强度为（＋～2 ＋），无背景着色；4%中性甲醛固定液的组织效果较差，IgA、C3 在肾小球的沉积结果为（±～＋），见图1 ～2。

图1 IgA 在肾小球的沉积情况（免疫荧光染色，×400）

图2 C3 在肾小球的沉积情况（免疫荧光染色，×400）

表1 两种抗原标记物在3 组中的表达情况（ =58） 例（%）

3 讨论

临床上肾小球肾炎根据肾组织病变范围及肾小球病变情况分类繁多，其病因及发病机制复杂。目前，肾脏病理检查结果已成为肾脏疾病诊断的权威标准，是制定肾脏疾病治疗方案和评估预后的重要依据[7]，而肾穿刺标本免疫荧光制片质量直接影响肾脏病理医师诊断结果的准确性。

新鲜肾脏穿刺活检组织冷冻切片后进行免疫荧光染色，其特异性强、敏感性高、操作步骤简单、定位准确及强度易于判断，通过荧光染色可判断有无免疫复合物沉积、沉积形态、部位及强度等[8]。免疫荧光染色的肾穿标本固定是为了保持组织细胞的形态结构，防止变形或破裂，且有利于保存细胞的抗原，提高免疫荧光检测的效率[9]。如果固定剂选择不适宜，就会导致组织破坏及结构不清晰，对随后的荧光染色产生极大影响，可导致假阳性率高及定位不准确，甚至导致误诊，延误患者病情，因此免疫荧光染色标本的固定应选择并优化适宜的固定剂[10]。目前很多医院的肾穿刺活检行免疫荧光检查所使用的固定剂首选以常温丙酮液为主[11]。本科室开始也采用常温丙酮液，发现有些标本容易出现假阴性，与临床诊断不符，故努力探索最佳固定方法，从而提高肾穿刺活检免疫荧光检查的准确性。

本研究对112 例肾脏穿刺活检组织标本的3 种固定剂固定效果进行比较，将58 例后期诊断为IgA肾病的荧光染色效果纳入统计。笔者经过反复实验后发现，4%的中性甲醛液为非沉淀性固定液，容易产生甲醛色素，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇改变，进而降低抗原敏感性[11]，并且其缺乏脱水能力，导致沉淀物不易聚集成团，组织浸于4%的中性甲醛液中容易造成细胞肿胀、胞核不清及结构模糊等[12]。而常温丙酮液虽然与4 ℃丙酮液均具有保存酶的作用，二者的主要作用都可促进蛋白质和糖沉淀，对组织渗透力强，一般应用于组织化学的酶固定。本研究发现经4 ℃丙酮液固定后的肾穿刺组织免疫荧光染色效果相对较佳，其机制是由于丙酮液在4 ℃预冷的状态下，固定液对组织的酶渗透性更强，可以更好地固定酶，提酶效果更好，更有利于保存抗原的免疫活性，进而更有利于免疫荧光显色，提高阳性检测率。

综上所述，采用4 ℃丙酮液固定的冰冻切片，对于肾病活检组织直接免疫荧光染色诊断准确率较高，在肾脏疾病的病理学检查中具有较高的推广和使用价值。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突