信号在冬小麦根系细胞中的产生及传导机理

祁伟亮,孟建军,张 成,刘自成,施万喜,杨 虓,乔 岩,杨财容,乔义林,李金玲,陈思伟,姚来来,赖守孝,张 鹏,刘文辉,王 婧,袁兰兰

(1.陇东学院 农林科技学院,甘肃庆阳 745000;2.陇东旱地作物种质改良及产业化协同创新中心,甘肃庆阳 745000;3.甘肃省旱地冬小麦种质创新与应用工程研究中心,甘肃庆阳 745000; 4.成都师范学院 化学与生命科学学院,特色园艺生物资源开发与利用四川省高校重点实验室,成都 611130)

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料有品种‘陇育5号’‘陇育8号’‘陇育10号’及品系‘陇育5-2’,源于陇东学院小麦研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 冬小麦遗传背景分析 为进一步明确冬小麦品种‘陇育5号’‘陇育8号’‘陇育10号’及品系‘陇育5-2’的遗传背景,染色体制片按照Qi等[14]的方法进行。首先将制备好的片子进行荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)分析,选用探针pSc119.2(绿色)和pTa535(红色)检测冬小麦品种‘陇育5号’‘陇育8号’‘陇育10号’及品系‘陇育5-2’的A、B、D染色体组。探针pSc119.2主要区分小麦B基因组,探针pTa535主要识别小麦A、B、D基因组[15]。探针pSc119.2和pTa535由上海英骏生物技术有限公司合成,杂交程序参照Fu等[16]和Qi等[14]的方法配置10 μL杂交液体系:pSc119.2(0.3 μL)+pTa535(0.3 μL)+9.4 μL(2 × SSC和 1×TE)缓冲液瞬时离心混合。每张载玻片上滴加10 μL探针工作液,置于37 ℃恒温水浴锅中杂交2 h,杂交完后用2×SSC溶液清洗,晾干后向每张载玻片上滴加10 μL DAPI复染液,黑暗环境下放置10 min后,然后用荧光显微镜(Olympus BX-51)采集照片。

1.2.2 ROS信号组织检测 挑选籽粒饱满的冬小麦种子,清洗干净、吸干、低温(4 ℃)春化12 h,以打破种子休眠。将冬小麦品种‘陇育5号’‘陇育8号’‘陇育10号’及品系‘陇育5-2’分别进行正常处理(25 ℃)、DPI+正常处理(25 ℃)、冷胁迫 (4 ℃)和DPI+冷胁迫(4 ℃)抑制处理。

正常处理(25 ℃)和DPI+正常处理(25 ℃):将冬小麦品种‘陇育5号’‘陇育8号’‘陇育10号’及品系‘陇育5-2’在正常处理(25 ℃)和 DPI+正常处理(25 ℃)条件下培养2 d,培养条件为昼夜温度(25 ℃),光/暗周期(14 h/10 h),光照度(6 000 lx)。因DPI+正常处理(25 ℃)后种子未发芽,对正常处理(25 ℃)1 d和2 d的材料进行ROS组织染色,染色方法参照 Kumar等[17]的方法,首先将氯化硝基四氮唑蓝(NBT)1%溶液倒入培养瓶,淹没种子并避光侵染8 h。其后将材料浸泡在无水乙醇中。最后用甘油浸制并固定试验材料并在正置荧光显微镜(BA410E)下拍照。DPI(317.92 μmol/L)称取10 mg二苯基氯化碘盐,以少许二甲亚砜溶解,用50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)定容至100 mL。

冷胁迫(4 ℃)处理和DPI+冷胁迫(4 ℃)抑制处理:为了明确冷胁迫处理后,冬小麦品种‘陇育5号’‘陇育8号’‘陇育10号’及品系‘陇育5-2’在冷胁迫(4 ℃)环境下的发芽率、根系和芽的生长情况及ROS信号在冬小麦组织细胞中的产生规律。首先将冬小麦品种‘陇育5号’‘陇育8号’‘陇育10号’及品系‘陇育5-2’在冷胁迫 (4 ℃)条件下培养7 d,培养条件为昼夜温度 (4 ℃),光/暗周期(14 h/10 h),光照度(6 000 lx)。然后分别对培养7 d的材料进行发芽率、根长和芽长测定,发芽率=种子发芽数/供试种子数×100%。

2 结果与分析

2.1 冬小麦遗传背景及种子发芽情况分析

为进一步明确冬小麦品种‘陇育5号’‘陇育8号’‘陇育10号’及品系‘陇育5-2’的遗传背景,以pSc119.2和pTa535为探针进行遗传背景分析,结果表明:‘陇育5号’(图1-a)、‘陇育5-2’(图1-b)、‘陇育8号’(图1-c)和‘陇育10号’(图1-d)等材料均属于六倍体材料(2n=42),染色体组成为AABBDD基因组。

以pSc119.2(绿色)和pTa535(红色)为探针对‘陇育5号’(a)、‘陇育5-2’(b)、‘陇育8号’(c)和‘陇育10号’(d)进行鉴定

在正常(25 ℃)环境下‘陇育5号’‘陇育5-2’‘陇育8号’和‘陇育10号’的发芽率无显著差异(P>0.05)且发芽率均在95%以上,这说明供试材料的种子生长活力较好。在4 ℃冷胁迫环境下培养7 d后,‘陇育5号’‘陇育5-2’‘陇育8号’和‘陇育10号’种子的发芽率分别为91.71%、 90.63%、72.45%和62.78%(表1),且冷胁迫 (4 ℃)环境下品系‘陇育5-2’和‘陇育5号’的长势显著好于‘陇育8号’和‘陇育10号’(图2),其中‘陇育5号’的芽长为2.15 cm,显著长于品系‘陇育5-2’,但品系‘陇育5-2’的根长为3.81 cm,显著长于‘陇育5号’(表1),这说明‘陇育5-2’和‘陇育5号’在冷胁迫环境下的适应能力存在差异性。

表1 冷(4 ℃)胁迫处理后冬小麦发芽率及生长情况

冬小麦‘陇育5号’(a)、‘陇育5-2’(b)、‘陇育8号’(c)和‘陇育10号’(d)

2.2 正常环境下在冬小麦组织细胞中的分布规律

冬小麦‘陇育5号’(a, b, c)、‘陇育5-2’(d, e, f)、‘陇育8号’(g, h, i)和‘陇育10号’(j, k, l)在正常环境下(25 ℃)培养1 d(a, d, g, j)和2 d(b, e, h, k)时,并采用NBT对冬小麦进行染色,蓝色聚合物沉淀代表在植株体内的富集程度。在正常环境下 (25 ℃)DPI处理冬小麦‘陇育5号’(c)、品系‘陇育5-2’(f)、‘陇育8号’(i)和‘陇育10号’(l)2 d

2.2 冷胁迫环境下,在冬小麦组织细胞中的分布规律

对冷(4 ℃)胁迫处理(a, b, c, g, h, i)和冷(4 ℃)胁迫+DPI处理 (d, e, f, j, k, l)后的冬小麦幼苗进行NBT染色,‘陇育5号’(a, d, g, j)、‘陇育5-2’(b, e, h, k)、‘陇育8号’(c, f, i, l)

3 讨 论

冬小麦是甘肃主要粮食作物,面积和产量均居全省口粮作物之首,其中旱地小麦约占 75%。而陇东作为甘肃冬小麦的主产区,因冬季严寒干旱、春季降水少,春旱和小麦生育后期高温等环境因素影响,导致冬小麦的越冬率、产量及品质等造成严重影响。因此选育强抗寒抗旱冬小麦品种,是促进甘肃冬小麦增产的有效的技术途径。目前在甘肃陇东等北部晚熟冬麦区生产推广的‘陇育5号’[19]、‘陇育10号’[20]和‘陇育8号’[21]等品种具有较强的抗寒、抗旱性和丰产性,其中‘陇育5号’成为北部冬麦区旱地甘肃陇东和宁夏固原的第一大品种,2017年被全国农技中心确定为“华北、西北地区耐旱节水品种”。本研究通过FISH技术分析,结果表明‘陇育5号’‘陇育8号’‘陇育10号’和品系‘陇育5-2’等材料均属于六倍体材料(2n=42)。在4 ℃冷胁迫环境下培养7 d后,‘陇育5-2’和‘陇育5号’的发芽率和长势显著好于‘陇育10号’‘陇育8号’,这说明‘陇育5-2’和‘陇育5号’在冷胁迫环境下具有较好的适应性。

3.2 NADPH酶介导产生的ROS在冬小麦细胞内及细胞间的信号传导机制