丹桃养肝丸对四氯化碳致肝纤维化大鼠的保护作用研究

卢芬萍,胡世平,唐颖慧,李粉萍,薛敬东,叶苗青

(1. 北京中医药大学,北京 100029;2. 北京中医药大学深圳医院,广东 深圳 518100;3. 陕西省中医医院,陕西 西安 710003)

肝纤维化是一个复杂的病理发展过程,是在慢性肝病过程中,由多种致病因子诱发肝内结缔组织异常增生,导致肝内细胞外基质(ECM)蛋白堆积而形成的纤维性瘢痕组织[1],一般由肝毒性损伤和胆汁淤积损伤引起。肝毒性损伤一般是由肝细胞的慢性损伤引起的,如乙型肝炎和(或)丙型肝炎、酒精或代谢综合征引起的非酒精性脂肪性肝炎。胆汁淤积损伤一般是由于胆汁流动受阻而引起的,如原发性和继发性胆管炎、原发性硬化性胆管炎和胆管闭锁[2]。肝纤维化是一种可逆转的生理病理过程,积极治疗可以延缓疾病发展,提高患者生活质量。但目前尚未有上市的标准的抗纤维化药物[3],因此开发安全、有效的抗肝纤维化药物是临床上亟须解决的问题。肝纤维化在中医多归为“肝着”“胁痛”等范畴。陕西省中医医院、国家名老中医专家成冬生主任医师认为肝纤维化患者多见肝血虚损、瘀血阻络证型,治之当活血化瘀、养血柔肝。因此根据其多年临床经验,研制出中药复方制剂丹桃养肝丸,临床应用效果较好。本课题组拟以四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化大鼠模型,进一步探讨丹桃养肝丸抗肝纤维化的作用,为临床应用提供客观依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 80只SD大鼠,体重150～200 g,雌雄各半,由西安交通大学医学院实验动物中心提供,许可证号:SCXK(陕)2007-001。饲养于陕西省中医药研究院中药研究所SPF级动物实验室中,饲养环境温度23～25 ℃,湿度40%～70%,昼夜明暗交替(12 h/12 h),每笼4～5只,饲养2周。本研究经陕西省中医医院伦理委员会审核通过(2022L01009)。

1.2药物 丹桃养肝丸:陕西省中医医院肝病科提供(批号分别为170801,170802,170803),生药含量为2.025 g/g;秋水仙碱片:云南植物药业有限公司生产,国药准字H53020166,规格:0.5 mg/片,批号:20090701。

1.3仪器与试剂 低温高速离心机(型号:centrifuge5810R,Eppendorf);可调微量移液管(规格:50～250 μL、500～1 000 μL,上海求精生化仪器厂);电子天平(型号:BS210S,精确度:0.1 mg,北京赛多利斯天平厂);组织研磨器(北京科实玻璃仪器有限公司);电热恒温水浴锅(型号:HH-2型,北京科伟永兴仪器有限公司,温度波动率±0.5 ℃)。 羟脯氨酸(Hyp)ELISA试剂盒(批号:20090717,南京建成生物工程研究所);CCl4(纯度≥99.5%,天津市天大化工实验厂);金龙鱼食用调和油(第二代,产品标准号:Q/KXOF07,西安嘉里油脂工业有限公司)。

1.4实验方法 随机取14只大鼠作为对照组,其余大鼠轮替给四肢内侧皮下注射50%植物油CCl4混悬液3 mL/kg,每周注射2次,共9周。并分别于造模开始后1周、5周、9周进行随机抽检,每次取对照组大鼠1只、造模大鼠2只,直至造模大鼠肝组织切片出现明显的纤维增生。除去造模过程中死亡的3只和抽检的9只大鼠外,将剩余的造模成功大鼠按体重随机分为模型组11只、秋水仙碱组12只、丹桃养肝高剂量组10只、丹桃养肝中剂量组11只、丹桃养肝低剂量组10只。对照组和模型组给予去离子水灌胃,秋水仙碱组给予秋水仙碱0.75 mg/kg灌胃,丹桃养肝高、中、低剂量组分别给予丹桃养肝丸6 g/kg、3 g/kg、1.5 g/kg灌胃,均1次/d,连续3周。

1.5检测指标及方法

1.5.1血清肝酶指标水平 大鼠于末次灌胃后禁食12 h,10%乌拉坦麻醉,颈总动脉采血,离心后取血清,采用全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GTT)水平,计算AST/ ALT值。

1.5.2脏器指数和肝组织中Hyp含量 取血后处死大鼠,分离肝、脾和胸腺,称重,计算各脏器指数。称重后各组称取同一部位肝脏组织1 g(湿重),加5 mL生理盐水制成匀浆,离心,采用Hyp试剂盒测定肝组织中Hyp含量。

1.5.3肝组织病理形态及肝纤维化评分 肝脏组织用10%福尔马林溶液固定,取材,常规石蜡包埋,连续切片,对肝组织切片行HE染色,用LEICA生物显微镜进行观察。依照以下评分标准对肝纤维化情况进行评分:0级(0分),无纤维化;Ⅰ级(1分),纤维结缔组织局限于汇管区或汇管区扩大;Ⅱ级(2分),纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3,形成不完全间隔,同时有Ⅰ级样改变;Ⅲ级(3分),纤维结缔组织增生进入肝小叶达中央静脉周围,有个别菲薄的完全间隔形成(假小叶),或较厚的不完全间隔;Ⅳ级(4分),纤维结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生,完全间隔较厚,假小叶大量形成,并有Ⅲ级样改变[4]。

2 结 果

2.1各组大鼠血清肝酶指标比较 模型组大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP水平与对照组相比有上升趋势,AST/ALT有下降趋势,但差异均无统计学意义(P均>0.05)。丹桃养肝低剂量组大鼠血清AST水平和丹桃养肝中、低剂量组大鼠AST/ALT值均明显低于模型组(P均<0.05);丹桃养肝各组大鼠血清ALT水平和丹桃养肝低剂量组大鼠血清GGT水平有降低的趋势,但与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 对照组和肝纤维化各组大鼠血清肝酶指标水平比较

2.2各组大鼠脏器指数及肝组织中Hyp含量比较与对照组比较,模型组大鼠肝脏指数、脾脏指数有升高趋势,胸腺指数有降低趋势,但差异均无统计学意义(P均>0.05);肝组织中Hyp含量明显升高(P<0.05)。与模型组比较,秋水仙碱组和丹桃养肝高、中剂量组大鼠胸腺指数均明显增高(P均<0.05),肝组织中Hyp含量均明显降低(P均<0.05)。见表2。

表2 对照组和肝纤维化各组大鼠脏器指数及肝组织中Hyp含量比较

2.3各组大鼠肝脏病理组织学形态及肝纤维化评分比较 对照组大鼠的肝小叶结构清晰,肝细胞无明显变性、坏死,肝小叶内及门管区无明显纤维组织增生及炎性细胞浸润;肝纤维化评分为(1.09±0.15)分。模型组大鼠肝组织内重度纤维组织增生,增生的纤维组织形成纤维隔、假小叶,门管区出现炎性细胞浸润;肝纤维化评分为(1.73±0.61)分,明显高于对照组(P<0.05)。秋水仙碱组和丹桃养肝高、中、低剂量组大鼠肝纤维化评分分别为(1.00±0.46)分、(0.90±0.49)分、(0.91±0.45)分、(1.30±0.51)分,秋水仙碱组和丹桃养肝高、中剂量组肝纤维化评分均明显低于模型组(P均<0.05),镜下见肝组织内的纤维组织增生较轻。见图1。

图1 对照组和肝纤维化各组大鼠肝脏病理形态(HE染色,×100)

3 讨 论

病毒性或代谢性慢性肝病引起的肝纤维化是全球健康面临的重大挑战。肝纤维化是影响肝脏疾病转归和引发肝细胞癌的关键因素,与肝脏疾病的进展密切相关[5]。目前,肝纤维化的治疗主要以病因治疗为主,如抗病毒、调节代谢紊乱、免疫抑制等,尚不能完全改善肝纤维化[6],奥贝胆酸、多烯磷脂酰胆碱等药物虽然在动物实验中显示有较好的抗肝纤维化作用,但临床试验中一直存在缺陷和不足[7]。

丹桃养肝丸为名中医成冬生主任医师的经验方,由丹参、桃仁、当归、黄芪、枸杞子、太子参、叶下珠、柴胡组成。方中丹参、桃仁活血化瘀,养血止痛,凉血消肿,发挥推陈致新之功,不论血滞血结,新瘀久瘀,均可取效;当归补血、活血、止痛;黄芪、枸杞子、太子参益气养血;柴胡疏肝解郁,可引诸药入肝经;叶下珠清热利湿、解毒平肝。诸药配伍,共奏活血化瘀、养血柔肝之效。现代药理研究证实,丹参中活性成分丹参酮ⅡA可有效降低肝脏的氧化应激反应,抑制肝细胞凋亡,改善肝功能,同时可通过靶向调节肝星形细胞、内源性干细胞、Smad6/7蛋白抑制肝纤维化[8-9]。桃仁提取物可通过增加肝血流量,促进Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原降解,阻止Ⅰ、Ⅱ型前胶原沉积,抑制脂质过氧化损伤等作用预防肝纤维化的形成[10]。黄芪具有抗衰老、抗炎、抗肺纤维化等作用,环黄芪醇可通过降低糖酵解水平抑制肝纤维化的发展[11]。当归阿魏酸可通过抑制肝星形细胞的增殖发挥抗纤维化作用[12]。欧当归内酯A可通过抗脂质过氧化损伤,改善内皮细胞功能,抑制肝纤维化[13]。枸杞多糖可以通过调节胰岛素样生长因子-2(IGF-2)和胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)在血液和肝组织中的表达来缓解肝纤维化损伤[14]。柴胡皂苷D具有抑制肝星形细胞活化、减轻肝脏炎症的作用[15]。太子参具有调节免疫、抗氧化、降血糖、抗应激等作用[16]。叶下珠可通过抑制氧化应激和炎症反应,调控α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达发挥抗肝纤维化作用[17]。

腹腔注射肝毒性物质CCl4可导致肝内组织损伤及炎症,引起肝纤维化的发生[18]。肝纤维化时肝细胞损伤、坏死,ALT、AST释放入血,血清中ALT、AST水平升高,二者水平可反映肝损伤情况,但缺乏特异性[19]。由于ALT主要位于肝细胞胞浆内,AST主要位于肝细胞线粒体内,因此轻度肝脏损伤时,以ALT升高为主;当肝细胞严重受损,线粒体发生病变时,会造成AST升高,且AST/ALT值越高提示肝细胞损伤越重。本实验结果显示,中、低剂量丹桃养肝丸能下调肝纤维化大鼠血清中AST水平及AST/ALT值,表明丹桃养肝丸对肝纤维化损伤的细胞有一定保护作用,中、低剂量作用明显分析与丹桃养肝丸为中成药制剂,化学成分多,药理作用复杂,药物在体内经肝脏代谢酶代谢后药物的吸收代谢过程相关,具体的作用机制还需要进一步实验验证。

脏器指数是反映动物功能状态的重要指标,胸腺和脾脏作为机体的免疫器官,二者指数可直接反映机体的免疫功能状态[20]。肝纤维化时导致肝细胞肿胀、炎性浸润, 进而发生代偿性增生,肝脏质量增加[21],但目前没有研究证实肝指数与抗肝纤维化疗效具有直接的关系[22]。本实验结果显示,模型组的胸腺指数下降,肝指数升高,提示造模后胸腺萎缩,肝细胞损伤;丹桃养肝高、中剂量组大鼠胸腺指数均明显高于模型组,提示丹桃养肝丸可上调肝纤维化大鼠胸腺指数,有增强免疫作用,但对肝指数影响不明显。肝组织内Hyp含量是衡量肝脏胶原组织代谢的重要指标,能客观地反映肝纤维化程度及其演变过程[23]。本实验结果显示,丹桃养肝丸可显著降低肝组织中Hyp含量,对大鼠肝纤维化具有一定的保护作用。肝组织病理染色显示,模型组肝组织炎细胞渗出和纤维组织增生明显,有部分形成假小叶,而丹桃养肝高、中剂量组的肝纤维化程度明显轻于模型组,并且肝纤维化评分明显降低,表明丹桃养肝丸可改善肝纤维化大鼠肝组织损伤,减轻肝纤维化程度。

综上所述,丹桃养肝丸可改善肝纤维化大鼠肝功能,提高脏器免疫功能,减少胶原纤维生成,减轻肝纤维化损伤,抑制肝纤维化形成,但其具体作用机制有待进一步研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。