当归芍药散对肝纤维化大鼠的干预作用及对TLR4通路的影响

王 雯,胡传国,梁伟林

(1. 新疆维吾尔自治区人民医院,新疆 乌鲁木齐 830001;2. 解放军总医院京西医疗区,北京 100144)

肝纤维化是临床中常见的肝脏疾病,多见于病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等患者。肝纤维化如不能及时得到治疗,会进展为肝硬化,甚至肝癌[1]。目前对于肝纤维化尚缺乏有效的治疗药物,主要是改善肝功能、调节肝脏血流动力学等对症治疗,但上述方法均不能有效遏止肝纤维化的进展,所以肝纤维化治疗药物的研发仍是目前工作重点[2]。研究发现,Toll 样受体 4(TLR4)通路是肝纤维化发生及发展的关键信号通路,其相关蛋白异常表达会促进肝组织胶原蛋白沉积等纤维化病理改变,而调节TLR4通路相关蛋白的表达能够抑制肝纤维化的进展[3-4],由此可见,调节TLR4通路可能是肝纤维化治疗的有效途径。当归芍药散是基于中医学理论由当归、芍药等组成的中药制剂,近年来研究表明其对于肝纤维化具有一定的改善作用[5-6],然而其具体作用机制尚不明确。本实验基于TLR4通路探讨了当归芍药散对肝纤维化大鼠的改善作用,以进一步明确其药理作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 75只健康清洁级雄性SD大鼠,6～8周龄,由广东省实验动物监测所提供,实验动物生产许可证号:SCXK(粤)2018-0044。大鼠饲养于实验动物房,温度20～25 ℃,相对湿度40%～60%,自然光照,自然饮食。本实验经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会审核批准(KY20210623087)。

1.2药品及试剂 当归芍药散由中药配方颗粒当归(批号:1903251)9 g、芍药(批号:1907081)15 g、川芎(批号:1904282)15 g、茯苓(批号:1812111)12 g、白术(批号:1909101)12 g组成,购自广东一方制药有限公司;TAK-242(货号:CLI-095,美国MedChemExpress公司);大鼠白细胞介素-6(IL-6,货号:PI328)、白细胞介素- 1β(IL-1β,货号:PI303)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α,货号:PT516)ELISA试剂盒和PCR反应试剂盒(货号:D7250)、二氨基联苯胺(货号:P0203)购自碧云天生物科技有限公司;Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ) ELISA试剂盒(货号:JL20754,上海江莱生物科技有限公司);Ⅲ型前胶原(PC Ⅲ) ELISA试剂盒(货号:FN-ER0325,武汉菲恩生物科技有限公司);透明质酸(HA) ELISA试剂盒(货号:DS-250,上海广锐生物科技有限公司);层黏连蛋白(LN)ELISA试剂盒(货号:SBJ-R0796,南京森贝伽生物科技有限公司);Masson染色试剂盒(货号:G1340)、RNA提取试剂盒(货号:R1200)、过氧化物酶标记链霉素亲和素(货号:SE068)、BCA蛋白测定试剂盒(货号:PC0020)购自北京索莱宝科技有限公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(货号:ab150077)、TLR4兔多克隆抗体(货号:ab217274)、髓样分化因子88(MyD88)兔单克隆抗体(货号:ab219413)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(TRAF6)兔单克隆抗体(货号:ab33915)、GAPDH兔单克隆抗体(货号:ab181602)购自艾博抗上海贸易有限公司;cDNA反转录试剂盒(货号:WLA101,万类生物科技有限公司);PCR引物设计及合成由赛默飞世尔科技有限公司完成。

1.3设备与仪器 ADVIA 2400全自动生化分析仪(西门子股份有限公司);3-30KS台式冷冻离心机(德国Sigma公司);E-Gel Imager凝胶成像仪(赛默飞世尔科技有限公司);Mastercycler nexus GX2梯度PCR仪(Eppendorf 艾本德中国有限公司);IX83荧光倒置显微镜(奥林巴斯销售服务有限公司);SpectraMax iD5酶标仪(美谷分子仪器有限公司)。

1.4实验方法 随机取12只大鼠作为正常组,其余大鼠参照文献[7]方法建立肝纤维化模型:首次腹腔注射40%的CCL4-橄榄油溶液5 mL/kg,随后按照3 mL/kg隔日1次腹腔注射,持续8周后,随机取3只大鼠验证造模是否成功(以肝组织纤维增生视为造模成功)。将造模成功大鼠随机分为肝纤维化组、TAK-242组及当归芍药散低、中、高剂量组,每组12只。参考文献[8]确定当归芍药散给药剂量,低、中、高剂量组分别按照2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg (以生药含量计)灌胃给予当归芍药散;参考文献[9],TAK-242组腹腔注射3 mg/kg TAK-242,正常组和肝纤维化组给予生理盐水灌胃。各组干预均1次/d,连续13周。

1.5检测指标及方法

1.5.1血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)水平 末次干预24 h后麻醉各组大鼠,眼眶静脉丛取血,于4 ℃条件下静置1 h后,以3 000 r/min速度4 ℃离心10 min,使用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST、ALP水平。

1.5.2血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平 腹主动脉取血,分离血清,按照试剂盒说明测定IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.5.3肝组织中Col-Ⅳ、PC Ⅲ、HA、LN水平 取血后处死各组大鼠,分离肝组织,取部分肝组织研磨匀浆,按照试剂盒说明测定肝组织匀浆液中Col-Ⅳ、PC Ⅲ、HA、LN水平。

1.5.4肝组织病理学表现 取各组大鼠部分肝组织石蜡切片,使用Weigert铁苏木精染色5 min,酸性乙醇分化10 s,蒸馏水冲洗后Masson蓝化液染色5 min,蒸馏水再次冲洗后,丽春红染色5 min,经磷钼酸溶液清洗后,使用苯胺蓝染色1 min,依次经梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理,中性树脂封片后置于显微镜下检查。

1.5.5肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA表达情况 取各组大鼠部分肝组织,提取总RNA并反转录为cDNA,根据试剂盒说明测定TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA表达量,引物序列见表1。反应程序为92 ℃预变性3 min,92 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,进行40个循环,68 ℃最终延伸10 min。反应体系:PCR Master Mix 10 μL,正向、反向引物各5 μL,cDNA模版2 μL,加入蒸馏水补充体积至20 μL。

表1 各基因RT-PCR检测引物序列

1.5.6肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达免疫组化染色及平均光密度值 取各组大鼠部分肝组织,4%中性甲醛中固定24 h后,使用石蜡包埋,进行5 μm切片,依次脱蜡、水化、封闭液封闭、抗原修复后,分别使用TLR4、MyD88、TRAF6兔抗体(1∶500稀释)和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(1∶2 000稀释)孵育后, PBS洗涤5次,加入过氧化物酶标记的链霉亲和素,在37 ℃烘箱中孵育30 min,再次使用PBS洗涤5次后,使用二氨基联苯胺显色后,依次复染、脱水、透明处理,封片,在显微镜下观察并拍照,使用ImagePro Plus6.0软件进行定量分析。

1.5.7肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达情况 取各组大鼠部分肝组织,提取总蛋白并进行定量,使用凝胶电泳分离蛋白,5%脱脂奶粉封闭后,依次经TLR4、MyD88、TRAF6、GAPDH兔抗体(1∶500稀释)及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(1∶2 000稀释)孵育后,ECL化学发光液显影后用凝胶成像系统成像,使用ImageJ v1.8.0处理图像并对各蛋白灰度值进行定量。

1.6统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行数据统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠血清ALT、AST、ALP水平比较 肝纤维化组血清ALT、AST、ALP水平均明显高于正常组(P均<0.05);当归芍药散各组及TAK-242组血清ALT、AST、ALP水平均明显低于肝纤维化组(P均<0.05),且当归芍药散低、中、高剂量组各指标水平呈剂量依赖性降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 正常组和肝纤维化各组大鼠血清ALT、AST、ALP水平比较

2.2各组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较 肝纤维化组血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明显高于正常组(P均<0.05);当归芍药散各组及TAK-242组血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明显低于肝纤维化组(P均<0.05),且当归芍药散低、中、高剂量组各指标水平呈剂量依赖性降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 正常组和肝纤维化各组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较

2.3各组大鼠肝组织中Col-Ⅳ、PC Ⅲ、HA、LN水平比较 肝纤维化组肝组织中Col-Ⅳ、PC Ⅲ、HA、LN水平均明显高于正常组(P均<0.05);当归芍药散各组及TAK-242组肝组织中Col-Ⅳ、PC Ⅲ、HA、LN水平均明显低于肝纤维化组(P均<0.05),且当归芍药散低、中、高剂量组各指标水平呈剂量依赖性降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表4。

表4 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织中Col-Ⅳ、PCⅢ、HA、LN水平比较

2.4各组大鼠肝组织病理学表现 正常组大鼠肝组织无明显病理学改变;肝纤维化组肝细胞排列不整齐,炎症细胞浸润,纤维化增生明显;与肝纤维化组比较,当归芍药散各组及TAK-242组肝组织中炎症细胞浸润和纤维化增生减轻,肝组织细胞排列较整齐。见图1。

图1 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织病理学Masson染色表现(×200)

2.5各组大鼠肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA表达情况 肝纤维化组肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05);当归芍药散各组及TAK-242组肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA相对表达量均明显低于肝纤维化组(P均<0.05),且当归芍药散低、中、高剂量组TLR4、MyD88、TRAF6mRNA相对表达量呈剂量依赖性降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表5。

表5 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA相对表达量比较

2.6各组大鼠肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6免疫组化染色表现及蛋白表达平均光密度值比较 肝纤维化组肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表达平均光密度值均明显高于正常组(P均<0.05);当归芍药散各组及TAK-242组肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表达平均光密度值均明显低于肝纤维化组(P均<0.05),且当归芍药散低、中、高剂量组TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达平均光密度值呈剂量依赖性降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2及表6。

表6 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达平均光密度值比较

2.7各组大鼠肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达情况比较 肝纤维化组肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05);当归芍药散各组及TAK-242组肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白相对表达量均明显低于肝纤维化组(P均<0.05),且当归芍药散低、中、高剂量组TLR4、MyD88、TRAF6蛋白相对表达量呈剂量依赖性降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图3 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织中TLR4、MyD88及TRAF6蛋白表达情况

3 讨 论

肝纤维化是由于病毒性肝炎、自身免疫性肝病、脂肪肝等多种肝脏疾病引起的肝组织细胞损伤,进而导致肝组织在多种细胞因子的作用下出现结缔组织异常增生所致。临床中,肝纤维化患者通常以食欲减退、慢性消化不良、消化道出血等为主要临床特征,若不及时干预,可能会进展为肝硬化,严重影响患者的生活质量,同时随着肝纤维化的进展,甚至可能发展为肝癌,危及患者生命[10]。目前对肝纤维化的治疗手段有限。

当归芍药散有健脾养血、利湿消肿等功效,用于治疗肝脾两虚等病症。方中芍药为君药,有柔肝缓脾、养血敛阴的功效;白术、茯苓生血补气,健脾运气,为臣药;当归养血活血,川芎活血行气,泽泻消肿祛湿、利水泄热。近年来临床及实验研究发现当归芍药散可改善肝纤维化,如刘翔[11]研究表明,当归芍药散联合异甘草酸镁能够显著改善肝硬化患者肝脏纤维化,降低患者口干、皮肤瘙痒、黄疸及乏力的发生率;赖志红等[12]研究发现,当归芍药散能够显著降低肝硬化患者的门静脉血流量、门静脉主干及脾静脉内径,改善血流动力学,抑制肝纤维化的进展;王雯等[13]研究表明,当归芍药散联合恩替卡韦较单独应用恩替卡韦能显著抑制肝炎患者的纤维化进展;李文武等[14]研究发现,当归芍药散能保护肝组织细胞,抑制胶原蛋白的产生,进而显著减轻肝组织纤维化程度。由此可见,当归芍药散在肝纤维化的治疗中具有较大潜力。

ALT、AST及ALP是反映肝功能状态的临床常用指标,这些指标水平升高提示肝组织细胞受损[15];IL-6、IL-1β及TNF-α为常见的炎症因子,参与肝纤维化的形成,且这些指标水平与患者的肝纤维化程度呈正相关[16];张海涛等[17]发现降低肝纤维化患者血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平能够提高肝纤维化的治疗效果。Col-Ⅳ、PC Ⅲ、HA及LN是反映体内组织器官纤维化改变的重要指标,参与肝纤维化的发生及进展[18],下调肝组织中Col-Ⅳ、PCⅢ、HA、LN水平则能够抑制肝星状细胞的激活及胶原蛋白的沉积,进而抑制肝纤维化进展[19]。本实验结果表明,肝纤维化大鼠血清ALT、AST、ALP、IL-6、IL-1β、TNF-α水平及肝组织中Col-Ⅳ、PCⅢ、HA、LN水平均显著升高,而当归芍药散各组大鼠上述指标水平均明显降低,提示当归芍药散能够显著改善大鼠肝功能,抑制大鼠体内炎症反应和肝组织胶原沉积,进而抑制肝组织纤维化的发生发展。

TLR4通路是近年来发现的与肝纤维化进展密切相关的重要信号通路。TLR4在被病毒、炎症因子等激活后,通过MyD88及TRAF6等蛋白进行信号传导,进而参与多种级联反应。王海兰等[20]研究发现,TLR4及MyD88水平的升高会激活肝星状细胞,进而导致肝纤维化的发生;庄子锐等[21]研究证实下调TLR4及MyD88表达能够显著抑制肝纤维化的发生及进展;王明亮等[22]研究表明,TLR4、MyD88、TRAF6水平的升高会激活肝星状细胞,进而导致细胞外基质沉积,进而参与肝纤维化及肝组织炎症的发生。由此可见,调节TLR4通路可能是治疗肝纤维化的有效途径和手段,TAK-242是目前实验室常用的TLR4通路抑制剂,因此本实验使用TAK-242作为阳性对照药物。本实验结果表明,肝纤维化组大鼠肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA及蛋白表达量和平均光密度值明显升高;当归芍药散各组大鼠肝组织中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA及蛋白表达量和平均光密度值均明显降低,且呈依赖性降低。提示当归芍药散能够剂量依赖性地抑制TLR4通路的激活,进而抑制肝纤维化的发生及进展。

综上所述,当归芍药散能够改善肝纤维化大鼠肝功能,抑制肝组织炎症改变和肝组织纤维化,其机制可能与调节TLR4通路有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。