升阳益胃汤加减对溃疡性结肠炎大鼠肠道炎症和黏膜屏障的影响

吕小燕,张 瑜,冯五金

(山西省中医药研究院(山西省中医院), 山西 太原 030024)

溃疡性结肠炎是一种以直肠、结肠黏膜非特异性炎症、溃疡形成为主要特征的病变,其临床表现主要为反复发作的腹泻、黏液脓血便、里急后重、腹痛等[1]。病程迁延日久,伴随着肠内外多种并发症,严重影响患者的健康和生活质量[2]。氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等基础药物治疗该病存在患者耐受性欠佳、疗效不稳定、停药后复发、骨髓抑制、潜在感染、肿瘤风险、激素依赖等憋端[3-6],升阶梯生物制剂在临床应用中也遇到疗效不佳的“瓶颈”[7],给患者及家庭带来沉重的经济和心理负担[8],有必要从溃疡性结肠炎发病的关键点——肠黏膜屏障[9]损伤角度探究中医药扶正祛邪治疗该病的效应机制。升阳益胃汤加减方是在脾胃学说创始人李东垣的“升阳益胃汤”益气健脾祛湿基础上,结合溃疡性结肠炎久病及肾的中医理念加仙茅、仙灵脾、厚朴组成,具有益气健脾、补肾祛湿解毒之功效。课题组前期的临床观察发现该方可有效治疗脾虚型溃疡性结肠炎活动期患者,为进一步探究其效应机制,本研究从肠黏膜屏障损伤角度观察了其对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障蛋白及炎症因子表达的影响。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD大鼠40只,雌雄各半,体重190～210 g,由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供,动物合格证号:110324210102969274。大鼠饲养于山西省中医药研究院东山科教院区实验中心动物房,室内温度22～24 ℃,空气相对湿度50%～60%,12 h光照和黑暗循环。本实验经山西省中医药研究院审核通过(SZYLY2021KY-0328)。

1.2药物与试剂 升阳益胃汤加减煎剂由黄芪30 g、半夏9 g、党参15 g、炙甘草5 g、羌活15 g、独活15 g、防风15 g、炒白芍15 g、炒白术30 g、陈皮15 g、茯苓30 g、柴胡9 g、泽泻15 g、黄连3 g、仙茅9 g、仙灵脾9 g、厚朴15 g组成,由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供并熬制成水煎剂,按标准成人剂量与大鼠转换系数6.25,含生药量为31.73 g/kg。美沙拉秦肠溶片(德国福克公司生产,批号:L18876A,规格:0.5 g/袋),用量为0.34 g/kg, 至研磨机中研至呈细微粉末,加100 ℃热水搅拌均匀,置容器中密封备用。紧密连接蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)、白细胞介素-6(IL-6) 、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体( Abcam 公司),葡聚糖硫酸钠(DSS,上海麦克林生化科技有限公司生产,批号:C12469988)。

1.3实验方法 大鼠适应性喂养1周后,标号、称重,随机分为正常组、模型组、升阳益胃汤组和美沙拉秦组,每组10只。模型组、升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠上午按1 mL/100 g体重予5%DSS溶液(5 mg DSS定容于100 mL蒸馏水)灌胃,同时予5%DSS溶液自由饮用;下午升阳益胃汤组大鼠按1 mL/100 g体重予升阳益胃汤加减煎剂灌胃,美沙拉秦组予美沙拉秦肠溶片粉末溶液灌胃。正常组大鼠按1 mL/100 g予纯净水灌胃及自由饮水。实验进行20 d。

1.4检测指标及方法

1.4.1大鼠生存状态及摄食量、体重、粪便含水率实验过程中观察各组大鼠生存状态,分别记录大鼠造模前及造模第1,7,14,20天摄食量、体重、粪便含水率。①24 h摄食量:对饲喂每只大鼠的食物称重,24 h后对剩余食物再次称重,二者之差即为该大鼠24 h摄食量。②体重:以电子秤测量。③粪便含水率:收集各组大鼠24 h粪便,置于电子天平称重量,为粪便初重。然后将粪便置于干燥箱内20 min左右,取出再次称重量,收集数据,反复干燥粪便,待其重量不再减少作为粪便末重。粪便含水率=(粪便初重-粪便末重)/粪便初重×100%。

1.4.2结肠组织形态 实验期满,大鼠禁食不禁水12 h,用10%水合氯醛腹腔麻醉后,取出结肠, 纵向切开肠腔, 用生理盐水冲洗肠道内容物,肉眼观察其结肠黏膜变化,后予中性福尔马林固定,然后水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋,冰冻切片机做连续冠状切片,片厚50 μm,隔5取1,切片收集于0.1 mol/L PBS,部分HE染色,光镜下观察并进行病理形态评分。0分:未见明显损伤;1分:上皮层和固有层炎细胞浸润,组织充血水肿程度轻,不超过膜下层,伴轻度腺体损伤;2分:炎症局灶性改变累及黏膜下层,且组织充血水肿程度显著,伴中度腺体损伤;3分:黏膜下层炎细胞形成灶状浸润,上皮坏死,溃疡深大,可累及肌层,伴严重黏膜腺体损伤。

1.4.3结肠黏膜组织中ZO-1、Occludin、IL-6、TNF-α表达情况 室温下,取实验大鼠结肠组织冰冻石蜡切片,依次漂洗、封闭处理、一抗孵育、漂洗、二抗孵育、DAB显色、复染、脱水、透明,封片后显微镜下观察不同部位ZO-1、Occludin、IL-6、TNF-α表达情况。参照《免疫组织化学检测技术共识》[10]的评分标准,根据阳性细胞染色程度及着色细胞百分率对各指标进行评分并统计:0分不着色,1分浅棕色,2分深棕色;着色细胞<5%为0分,5%～25%为1分,26%～50%为2分,>50%为3分。两种分值相加,0～1分为(-);2分为弱阳性(+);2～3分为阳性();4～6分为强阳性()。

1.5统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件分析数据。计量资料如符合正态分布,组间比较采用t检验;不符合正态分布的计量资料和计数资料用Kruskal-WallisH非参数检验并计算平均秩次,2组间比较采用Mann-WhitneyU非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠生存状态比较 正常组大鼠大便成形、色黄,皮毛浓密、光洁,体态正常,食欲可,体重逐日增加。模型组大鼠在造模第4天出现少许黏液便;第6天食欲减退,进食量减少,后逐渐出现精神不振、乏力、喜静少动、悬空拉尾抗力减弱、自发活动减少、皮毛粗糙;第16天出现血便。升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠较正常组稍差,比模型组明显改善。造模结束后,模型组、美沙拉秦组各有1只大鼠死亡,升阳益胃汤组有2只大鼠死亡,正常组大鼠均存活。

2.2各组大鼠摄食量、体重、粪便含水率比较 造模前和造模第1天各组大鼠的体重、摄食量、粪便含水率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。造模第7,14,20天,模型组大鼠摄食量、体重均明显低于同期正常组(P均<0.05),粪便含水率均明显高于同期正常组(P均<0.05),但粪便含水率呈递减趋势;升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠摄食量、体重均明显高于同期模型组(P均<0.05),粪便含水率第7天明显高于同期模型组(P<0.05),第14,20天均明显低于同期模型组(P均<0.05),且大鼠摄食量、体重逐渐增加,粪便含水率逐渐减少。见表1～3。

表1 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠不同阶段摄食量比较

表2 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠不同阶段体重比较

表3 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠不同阶段粪便含水率比较

2.3各组大鼠结肠组织形态 正常组大鼠结肠黏膜上皮组织整齐,细胞排列密集,可见杯状隐窝,无炎性细胞浸润,未见糜烂、溃疡。模型组大鼠结肠黏膜上皮缺损,基本无结构完整的隐窝,黏膜及黏膜下层见大量炎细胞浸润。升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠结肠黏膜上皮部分中断,与模型组相比缺损面积小,部分隐窝结构破坏,可见少许炎性细胞浸润。见图1。

2.4各组大鼠结肠组织病理评分比较 模型组大鼠病理评分明显高于正常组(P<0.05),升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠病理评分均明显低于模型组(P均<0.05)。见表4。

表4 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠组织病理评分比较

2.5各组大鼠结肠黏膜组织中ZO-1、Occludin表达情况比较 模型组结肠黏膜组织中ZO-1、Occludin阳性表达较少,表达评分均明显低于正常组(P均<0.05);升阳益胃汤组和美沙拉秦组肠黏膜组织中ZO-1、Occludin阳性表达较多,表达评分均明显高于模型组(P均<0.05)。见图2、图3及表5。

图2 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中ZO-1表达情况(免疫组化染色,×100)

图3 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中Occludin表达情况(免疫组化染色,×100)

表5 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中ZO-1、Occludin表达情况比较

2.6各组大鼠结肠黏膜组织中TNF-α、IL-6表达情况比较 模型组结肠黏膜组织中TNF-α、IL-6阳性表达较多,表达评分均明显高于正常组(P均<0.05);升阳益胃汤组和美沙拉秦组肠黏膜组织中TNF-α、IL-6阳性表达较少,表达评分均明显低于模型组(P均<0.05)。见图4、图5及表6。

图4 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中TNF-α表达情况(免疫组化染色,×100)

图5 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中IL-6表达情况(免疫组化染色,×100)

表6 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中TNF-α、IL-6表达情况比较

3 讨 论

溃疡性结肠炎发病具体机制虽未阐明,但近年研究表明肠黏膜屏障损伤基础上启动的肠道免疫失调是其发病的关键[11],在西药抗炎、抑制免疫治疗存在症状反复、患者不应答等正气亏虚的病情下,是否可以通过扶正修复损伤的肠黏膜屏障来解决溃疡性结肠炎治疗瓶颈的困惑呢?结合该病患者肠黏膜活检组织中肠上皮机械屏障破环及在正常/获得性肠道菌群和正常及获得性免疫条件下,肠黏膜屏障中紧密连接受损仍可启动肠道黏膜炎症的研究报道[12],再次提示临床需重视修复损伤的肠黏膜屏障在溃疡性结肠炎治疗中的重要作用。

本实验结果显示,溃疡性结肠炎大鼠的肠黏膜屏障主要的紧密连接蛋白Occludin和肠上皮细胞间的重要连接蛋白ZO-1低表达或几乎不表达,肠组织病理示结肠黏膜上皮缺损,基本无结构,与文献[13]报道一致;升阳益胃汤加减组大鼠的结肠黏膜上皮虽部分中断,但与模型组相比缺损面积小,肠黏膜屏障蛋白Occludin、ZO-1表达明显增加,表明该方有修复肠黏膜屏障的作用。

中医认为肠黏膜屏障损伤属于正气受损。升阳益胃汤加减方组方中黄芪益气健脾,生肌敛疮,参、苓、术、草四君子配伍橘皮以调理、培补后天脾胃之气,仙茅、仙灵脾补肾暖脾,具有益气健脾、补肾祛湿之功效。本实验结果显示,升阳益胃汤加减方可明显改善溃疡性结肠炎大鼠摄食量、体重、粪便含水率等脾虚证候,表明升阳益胃汤加减修复肠黏膜屏障的功能可能与其具有益气健脾、补肾扶正的功效有关。

炎症是溃疡性结肠炎重要的病理特征,TNF-α是贯穿溃疡性结肠炎发病过程中的重要细胞因子[14],由淋巴细胞、活化的单核巨噬细胞产生,可进一步刺激单核巨噬细胞和中性粒细胞等合成IL-6等促炎性细胞因子,通过STAT3/NF-κB等信号通路损伤细胞间的黏附分子,加重肠黏膜屏障破坏,肠黏膜通透性增加,继发免疫失调的炎症,形成恶性循环,致肠道持续性炎症[15]。中医认为肠道炎症隶属于湿、热、毒等病邪,升阳益胃汤加减方中的半夏、黄连、厚朴辛开苦降,化湿清热,泽泻、茯苓分消水湿,羌、独、柴、防升散祛湿、调畅气机,白芍养阴解痉,诸药合用,祛湿解毒。本实验结果显示,TNF-α、IL-6在溃疡性结肠炎大鼠的肠黏膜内高表达,黏膜及黏膜下层可见大量炎细胞浸润;升阳益胃汤组大鼠肠黏膜内TNF-α、IL-6表达明显减少,肠黏膜可见少许炎性细胞浸润,病理评分明显降低。提示升阳益胃汤加减可明显减轻溃疡性结肠炎肠道炎症。

综上所述,升阳益胃汤加减方可有效缓解溃疡性结肠炎大鼠的肠道炎症,机制可能与其益气健脾补肾修复肠黏膜屏障、祛邪抗炎有关。另外本研究中升阳益胃汤加减方和美沙拉秦肠溶片均显示出较好治疗溃疡性结肠炎的功效及调节ZO-1、Occludin、IL-6、TNF-α表达的作用,但与正常组大鼠相比仍有差距,提示中西药联合扶正祛邪抗炎治疗可能效果更好。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。