基于斑马鱼模型评价多肽红参饮调节气血作用

李开莹，郭朝万，陈 杰，裴运林，

（1.广东丸美生物技术股份有限公司，广东 广州 510000；2.广州美域医学检验有限公司，广东 广州 510000）

宋朝陈自明首次明确提出了“女子以血为本”的中医学理论，“今妇人之生，有余于气，不足于血，以其数脱血也”被记载于《灵枢·五音五味》中，提示女子以血为本的生理特点易产生“气有余而血不足”的情况[1]。女子的脉细、唇舌色淡、面色无华或萎黄，并伴有心悸、健忘、多梦失眠等症状是血虚的表现[2]。女性气血虚会导致出现一些疾病症状，如痛经[3]、月经过少病[4]、围绝经期综合征[5]、卵巢功能衰退[6]。针对以上女性问题，市面上功能性食品常用的药食同源原料有红参、阿胶和燕窝等。有研究表明，阿胶对盐酸苯肼型贫血小鼠有补血效果[7]，能够促进血细胞形式功能，提升人体造血能力[8]；燕窝具有提高细胞免疫功能和促使人体组织与细胞再生的作用[9]。利用现代酶解技术制备得到的相应的肽类成分，如阿胶肽[10]、燕窝肽和血肽等成分，因为其吸收率高及有效作用得到市场高度认可，但现有的研究报道主要集中在免疫调节和抗氧化作用[11-12]，在气血方面的作用无较多研究。另外，动物续血液制品将食源性活性肽作为主要成分与红参进行科学组合得到多肽红参饮（Polypeptide Hongshen Drink，PPHSD），研究此组合物在调节气血方面的作用，以验证经酶解处理后的肽类是否依旧保留原物质所具有的功效。

斑马鱼是一种非常重要的模式动物，这种动物作为一种哺乳动物在遗传学范畴上与人类相似，基因同源度高达87%[13]，相对于大鼠和小鼠动物试验，斑马鱼试验模型具有费用低、试验周期短的特点[14]。近年来，斑马鱼模型已被广泛用于功能性食品领域的功效评价，用于评价物质的调节免疫力作用[15-16]、改善微循环[17]、降血脂[18]、抗炎[19]、降血糖作用[20]和神经保护作用[21]等。该课题组采用斑马鱼模型，建立相应的试验模型，研究评价由食源性活性肽类为主要成分制备成的组合物饮品的调节气血，提高免疫力的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验动物

选取4 dpf 的野生型AB 品系斑马鱼用于评价PPHSD 改善贫血作用；选取4 dpf 黑色素等位基因突变型半透明Albino 品系斑马鱼用于评价PPHSD 改善微循环障碍作用；选取3 dpf 野生型AB 品系斑马鱼用于评价PPHSD 改善免疫力作用。斑马鱼均饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L 反渗透水中加入200 mg 速溶海盐，硬度为50~100 mg/L CaCO3，pH值为6.5~8.5，电导率为450~550 μs/cm），试验动物使用许可证号为：SYXK（浙） 2022-0004，饲养管理符合国际AAALAC 认证（认证编号：001458） 的要求。

1.1.2 试剂与仪器

二甲基亚砜（DMSO，批号BCCD8942，Sigma），Switzerland 公司提供；邻联茴香胺（批号MKBX3619V）， Sigma 公司提供； 苯肼 （批号YH0170509），上海依赫生物科技有限公司提供；甲基纤维素（批号C2004046），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供； 戊四唑 （PTZ， 批号YH0171126），上海依赫生物科技有限公司提供；Latex besads，carboxylate-modified polystyrene，fluirescent red 荧光微球（批号MKCB2036V），Sigma 公司提供。

解剖显微镜（SZX7），OLYMPUS 公司产品；CCD 相机（VertA1）；6 孔板，Nest 公司产品；精密电子天平（CP214），OHAUS 公司产品；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100），Nikon 公司产品；心跳血流分析系统（Zebralab3.） 3 PB2084C 公司产品；显微注射仪（IM-300），Narishige 公司产品；拉针仪（PC-10），Narishige 公司产品；行为分析仪（V3.11），ViewPoint Life Sciences 公司产品。

1.1.3 试验药物

多肽红参饮PPHSD 由阿胶肽、燕窝肽、血肽和红参等组成。多肽类成分为相应原料经过酶解工艺制备得到，然后将多种原料按科学配比经过溶解、均质、过滤等步骤制备得到。配方采用食品级原料组成，以保证长期服用无毒性。

瑞克R生血宁片，以下简称生血宁片，黑绿色片剂，批号为20211003，武汉联合药业有限责任公司提供，阴凉干燥贮存，用超纯水配制成50.0 mg/mL母液，现配现用；毛蕊异黄酮，白色粉末，批号211218044，华中海威（北京） 基因科技有限公司提供，冷藏干燥贮存。用DMSO 配制成3.41 mg/mL 母液，现配现用；破壁灵芝孢子粉，褐色粉末，批号为2112001，金日制药（中国） 有限公司提供，阴凉、干燥贮存，用超纯水配制成50.0 mg/mL 母液，现配现用。

1.2 试验方法

1.2.1 PPHSD 最大可用浓度考查（MTC）

在进行功效评价之前先考查3 种斑马鱼模型对不同质量浓度PPHSD 的耐受情况，使用质量浓度分别为72.9，146，292，583，1 167 μg/mL 的PPHSD对3 种模式斑马鱼进行毒性作用考查。随机选取对应模式斑马鱼于6 孔板中，30 尾/孔/试验组，分别水溶给予不同质量浓度的PPHSD 水溶液，同时设置正常对照组（标准稀释水） 和模型对照组，每孔容量为3 mL。在试验过程中，观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死亡的斑马鱼，确定不同质量浓度PPHSD 对不同模式斑马鱼的毒性作用。

1.2.2 研究PPHSD 的改善贫血作用

随机选取4 dpf 野生型AB 品系斑马鱼于6 孔板中，30 尾/ 孔。受试组分别水溶给予多肽红参饮PPHSD，阳性对照组给予生血宁片250 μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。28 ℃条件下处理6 h 后，除正常对照组外，其余各试验组均水溶给予苯肼建立斑马鱼营养性贫血模型。28 ℃条件下继续处理18 h 后，用邻联茴香胺染色，染色结束后每个试验组随机选取10 尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20 高级图像处理软件采集数据，分析统计斑马鱼心脏红细胞染色强度，以心脏红细胞染色强度的统计学意义评价多肽红参饮PPHSD 对营养性贫血改善作用。

1.2.3 研究PPHSD 的改善微循环作用

随机选取4 dpf 黑色素等位基因突变型半透明Albino 品系斑马鱼于6 孔板中，每孔均处理30 尾斑马鱼。分别水溶给予PPHSD，阳性毛蕊异黄酮4.26 μg/mL 质量浓度，同时设置正常对照组，每孔容量为3 mL。28 ℃处理1d 后，每个试验组随机选取10 尾斑马鱼置于斑马鱼心跳血液分析系统中录制视频并采集数据，分析节间血管血流速度，以该指标的统计学分析结果评价PPHSD 改善微循环功效。

1.2.4 研究PPHSD 的增强免疫力作用

随机选取3 dpf 野生型AB 品系斑马鱼于6 孔板中，30 尾/孔。受试组分别水溶给予PPHSD，阳性对照组给予破壁灵芝孢子粉2 000 μg/mL，同时设置正常对照组，每孔容量为3 mL。于28 ℃条件下处理4 d 后，每个试验组随机选取10 尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用Image J 软件分析并采集数据，分析斑马鱼荧光微球残留数目，以该指标的统计学分析结果评价PPHSD 增强免疫力功效。

1.3 数据处理

上述1.2.1~1.2.4 的研究结果均用mean±SE 表示，方差分析和Dunnett's T- 检验对结果进行统计学分析，p<0.05 表明具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 PPHSD 试验浓度确定

试验研究中所涉及的3 种斑马鱼模型的试验终点，PPHSD 在72.9~1 167 μg/mL 的所有浓度组中斑马鱼无死亡现象，也无明显形态和行为异常。在功效评价试验中，PPHSD 选取适宜浓度进行分组试验。

2.2 PPHSD 的改善贫血作用

多肽红参饮改善营养性贫血功效试验结果（n=10） 见表1。

表1 多肽红参饮改善营养性贫血功效试验结果（n=10）

由表1 可知，正常对照组斑马鱼心脏红细胞染色强度与模型对照组比较有显著性差异（p<0.001），而阳性对照药生血宁组斑马鱼心脏红细胞染色强度与模型对照组比较显著上升（p<0.001），表明模型建立成功。PPHSD 中、高浓度组292 和583 μg/mL 斑马鱼心脏红细胞染色平均强度分别为4 729 和4 789，与模型对照组比较显著增加，增加率为29.7%和31.34%，差异均显著（p<0.01)。结果表明，在该试验浓度条件下，PPHSD 对苯肼诱导的斑马鱼贫血具有明显的改善作用。

多肽红参饮处理后斑马鱼心脏红细胞染色强度典型图见图1。

图1 多肽红参饮处理后斑马鱼心脏红细胞染色强度典型图

由图1 可知，模型组的心脏红细胞染色程度明显比正常对照组少，多肽红参饮（PPHSD） 组心脏红细胞染色程度明显比模型组高，其结果与上述描述的一致。

2.3 PPHSD 的改善微循环作用

多肽红参饮改善微循环功效试验结果（n=10）见表2。

表2 多肽红参饮改善微循环功效试验结果（n=10）

由表2 可知，阳性对照组毛蕊异黄酮的血管血流速度与正常对照组相比，显著上升（p<0.001）。PPHSD 的低中高292，583，1 167 μg/mL 这3 个剂量组斑马鱼平均血管血流速度分别为646，665，674 μm/s，与正常对照组比较显著上升，分别提升了30.37%，34.10%，35.88%（p<0.05）。试验结果表明，PPHSD 可以促进正常斑马鱼的血液流动，改善斑马鱼微循环。

2.4 PPHSD 的增强免疫力作用

多肽红参饮对斑马鱼吞噬荧光微球作用（n=10）见表3。

表3 多肽红参饮对斑马鱼吞噬荧光微球作用（n=10）

由表3 可知，阳性对照组破壁灵芝孢子粉（2 000 μg/mL） 的斑马鱼体内荧光微球残留数目与正常对照组相比，降低率为21.39%，具有显著性（p<0.05）。PPHSD 的低中高72.9，146，292 μg/mL 这3 个剂量组斑马鱼体内荧光微球残留数目与正常对照组相比，分别降低31.96%，32.22%，32.73%，具有显著差异（p<0.01）。

红参多肽饮处理后斑马鱼荧光微球残留数目典型图见图2。

图2 红参多肽饮处理后斑马鱼荧光微球残留数目典型图

由图2 可知，多肽红参饮组（PPHSD） 红色荧光数明显少于正常对照组。当荧光微球在体内残留量少，说明斑马鱼体内巨噬细胞对外来异物的吞噬能力强。结果表明，PPHSD 具有增强免疫力作用。

3 结论

采用现代模式生物模型——斑马鱼模型研究组合物在气血调节方面的作用及作用机理。试验结果表明，72.9~1 167 μg/mL 质量浓度范围的PPHSD 对斑马鱼无毒性；292 和583 μg/mL PPHSD 组能够明显提升苯肼诱导的贫血斑马鱼的心脏红细胞染色强度增强，与模型对照组相比增加率为29.7%和31.34%，差异均显著（p<0.01）；给予PPHSD 的斑马鱼组的血管血流速度明显强于正常对照组，292，583，1 167 μg/mL 的PPHSD 对斑马鱼平均血管血流速度分别提升了30.37%，34.10%，35.88%，具有显著性差异（p<0.05）；72.9，146，292 μg/mL 的PPHSD明显降低斑马鱼体内荧光微球残留数目，与正常对照组相比分别降低31.96%，32.22%，32.73%，差异均显著（p<0.01），其增强免疫力作用明显且优于阳性对照破壁灵芝孢子粉。综上所述，食源性多肽为主的组合物具有增强免疫力、改善贫血及改善微循环作用，可改善斑马鱼的总体气血状况。试验结果与已有的原料功效认知相一致，具有综合调节机体免疫功能，共同改善机体贫血并增强免疫力的作用。不仅为此类活性多肽成分的功效提供试验佐证，而且也为具有评价此类功效提供了新的试验模型。