土壤和沉积物中22 种苯胺类化合物的测定——液相色谱法

钟福生，廖福然，舒金科

（重庆新天地环境检测技术有限公司，重庆 401122）

苯胺类化合物是具有高毒性的化工原料和中间产品，能通过多种形式进入人体，包括接触、吸入等，会对人体神经和心血管系统造成不可修复的伤害。由于苯胺类化合物溶于水，很容易在工业废水中残留并排放进土壤环境中[1]。土壤中的微生物很难降解苯胺类化合物，经年累月，该化合物在土壤中富集，破坏土壤结构，给环境带来不可逆转的污染伤害。因此学界一直在探索完善苯胺类化合物的测定方法。

目前，苯胺类化合物的各种测定方法研究介质截然不同，针对土壤和沉积物中苯胺类的测定方法仍然相对稀缺[2]。最新的液相色谱-三重四极杆质谱法（HJ1210-2021）标准只能测15 种苯胺类化合物，且所用仪器价格昂贵，检测成本高，远远不能满足实际检测需求[3]。因此,需要探索更加便捷有效的多种苯胺类测定液相色谱法。本研究旨在拓展土壤和沉积物中苯胺类化合物定性、定量检测类型的数量范围[4]。通过优化提取和净化的方法，提高样品前处理质量。通过改善液相色谱法分离条件，进行质量控制与保证技术研究来确定22 种苯胺类化合物检测分析方法的相关参数并进行方法验证。

1 实验过程

1.1 准备仪器与试剂

本研究所用主要仪器有KQ-500DV 型超声波清洗器（昆山）、H/T16MM 型离心机（湖南赫西）、EF-AADL24-RF 氮吹仪（上海安普）、1260 Ⅱ液相色谱仪（安捷伦）。

主要试剂有二氯甲烷、正己烷、丙酮、甲醇、甲酸、氨水、三氯乙酸、五水合硫代硫酸钠等。除了五水合硫代硫酸钠为分析纯，其余试剂均为色谱纯。

1.2 色谱条件

本研究选用优化后的色谱柱：AgiLent ZORBAX SBC18（4.6mm×50mm×1.8μm）。该色谱柱适用于高水溶性的弱碱性物质，分析结果显示图谱峰形对称，响应迅速且强烈，说明能较好地分离化合物。

流动相的pH 值是影响化合物保留时间的重要因素之一，因此选择的流动相在整个梯度洗脱过程中pH 值要恒定[5]。相比于乙腈，甲醇和0.01%甲酸溶液的响应值更强。最终的流动相为：甲醇纯试剂溶液,甲酸水溶液1+10000。

适当的流速控制是影响图谱分析的关键因素。流速太快时，离子化效率会降低；如果流速太慢，则分析时间长，容易出现拖尾问题。经过多次测试，将最佳流速限定在0.5 至1.2mL/min 之间。反复比较后确定当流速为1.0mL/min时，4-甲基苯胺、3-甲基苯胺和2-甲基苯胺能有效分离。此时最适宜的柱温为35℃，紫外波长为234nm。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

表2 土壤和沉积物加标0.125mg/kg 的准确度与回收率

1.3 样品前处理

本实验所用土壤、水体和海洋沉积物样品的采集分别按照HJ/T 166、HJ494 和GB 17378.3 的相关要求进行。将样品脱水冻干研磨至0.25mm 的颗粒，放置在清洗洁净的聚四氟乙烯棕色玻璃瓶中冷冻保存，并将温度控制在-18℃。

样品提取：称取2g 冻干样品至离心管中，加入1g五水合硫代硫酸钠，依次加入10.00mL 正己烷-丙酮混合溶剂和100μL 氨水，密封旋涡混匀。25℃以下冰浴超声提取30min，6000r/min 离心10min，取上清液经0.22μm 针式滤器过滤。

样品净化：分别用5mL 二氯甲烷和5mL 甲醇冲洗、平衡C18 固相萃取小柱。溶剂填满小柱后可关闭流速控制阀，使小柱得到充分浸润。5min 后缓慢打开控制阀。在此期间将2.00mL 过滤后的样品提取液转入柱内，保证移取工作在溶剂流干前完成。废弃多余的流出液后关闭控制阀。最后加入5mL 甲醇。等待5min 后打开控制阀收集洗脱液。

样品浓缩：将净化后的洗脱液氮吹浓缩至不少于0.8mL,用甲醇定容至1mL。

样品制备：将750μL 新鲜去离子水加入250μL 浓缩后的净化洗脱液中，并使两者混合均匀。再用0.22μm针式滤器过滤。

2 实验结果

2.1 标准曲线

由低到高依次配制至少5 个浓度点的标准系列，甲醇比例为25%。该方法在0.05～5mg/L 范围内正相关线性拟合趋势较好，拟合优度R 值均大于99.9%。

2.2 标准色谱出峰顺序

出峰顺序：（1）苯胺；（2）对硝基苯胺；（3）联苯胺；（4）3-硝基苯胺；（5）2-甲氧基苯胺；（6）2-甲基苯胺；（7）3-甲基苯胺；（8）对甲基苯胺；（9）对氯苯胺；（10）4-溴苯胺；（11）2,6-二甲基苯胺；（12）2,6-二甲基苯胺；（13）2-萘胺；（14）2.4-二甲基苯胺；（15）6-氯-2,4-二硝基苯胺；（16）2-溴-6-氯-4-硝基苯胺；（17）邻硝基对氯苯胺；（18）3,3-二氯联苯胺；（19）2-溴-4,6-二硝基苯胺；（20）2，6-二溴-4-硝基苯胺；（21）N-亚硝基二苯胺；（22）2，4，6-三氯苯胺。

2.3 检出限与测定下限

采用外标定量模式，分别计算实验室内检出限与测定下限。选择空白石英砂样品进行加标实验。目标化合物和不同土质会产生差异化的基质效应，因此要采用不同等级的异质性加标浓度。空白石英砂的加标浓度为0.125mg/kg、0.75mg/kg、1.25mg/kg，进行7次平行测定。称取空白石英砂2g 共7 份至离心管中，加入适量的浓度为5.0mg/L 苯胺类混合标准使用液。其余按照样品预处理的步骤进行平行测定。依据公式MDL=t(n-1099)×S 可知，当置信度为99%，平行测定7个样品时，t(6099)=3.143。测定下限为4 倍检出限。

得到的检出限中，13 种化合物的测定均值在3～5倍计算出的方法检出限的范围内，其余9 种化合物的测定均值在1～10 倍计算出的方法检出限的范围内。本实验室的方法检出限的确定方法与结果满足HJ168-2020 技术准则的要求。

2.4 精密度

相关精密度与准确度测试数据结果表示，采用空白加标的方式，各添加浓度样品的相对标准偏差范围控制在3.9%至18.9%，具有良好的精密度与准确度。平均加标回收率在68.8%至117%之间波动，回收效果良好。

2.5 实际样本准确度与加标回收率

选择土壤和沉积物实际样品进行加标实验。以0.125 mg/kg 的加标浓度进行7 次平行测定。结果显示，土壤和沉积物样品的平均加标回收率在72.0%～104%之间，相对标准偏差在5.3%～16.3%之间，具有良好的准确度与回收率。

3 结论

本研究成功建立了一种能同时测定土壤和沉积物中22 种苯胺类化合物的液相色谱方法，创新点有两方面。第一，成功利用超声萃取方法高效分离了22 种苯胺类化合物，在前处理抗干扰关键环节取得突破。采用正己烷：丙酮（1:1）萃取溶剂，C18 固相萃取小柱净化，用甲醇溶液洗脱，氮吹浓缩定容。第二，成功完成22 种苯胺类化合物的方法验证。利用高效液相色谱色谱仪分离测定，外标法定量，检出限范围在0.02～0.06mg/kg，平均加标回收率在68.8%～117%之间，相对标准偏差在3.9%～18.9%之间，结果的准确与精密性均达到了各项技术标准要求。本研究成果具有一定推广普及意义，利于土壤和沉积物中苯胺类化合物监测的全面实施。