达格列净对大鼠造影剂肾病的保护作用及机制

李依阳,邝日禹,张涛,苏晓琳,曾凤兰,雷玲艳,潘晓芬

(1.广西壮族自治区民族医院,广西 南宁 530001;2.联勤保障部队第923医院,广西 南宁 530021)

随着含碘造影剂在临床上愈加广泛的运用,造影剂肾病(CIN)现已成为第三位最常见的医院获得性急性肾损伤[1]。临床上使用较多的诊断标准是:血肌酐水平在造影剂暴露后24～48 h增加≥25%或较其基础值升高≥0.5 mg·dL-1[2-3]。CIN的发生将导致医疗费用增加、入院时间延长,增加病痛甚至死亡风险,严重影响患者的生存质量[4]。目前CIN的发病机制仍不清楚,亦无有效的治疗方法,多年来研究者试图通过更换造影剂种类、水化治疗及使用N-乙酰半胱氨酸治疗等措施仍未能有效阻止CIN的发生,且各种措施亦存在争议[5]。研究如何减少造影剂造成的肾损害,寻找有效的防治措施具有非常重要的临床意义。研究表明使用达格列净可明显改善患者血糖控制水平和肾脏功能[6-7]。本实验主要观察达格列净对造影剂诱导的急性肾损伤模型大鼠是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠,雄性,SPF级,体重180～220 g,斯贝福(北京)生物技术有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2019-0010。动物饲养环境温度20～25 ℃,湿度40%～60%。动物实验经广西民族医院伦理委员会批准,动物实验伦理审查证书编号:桂民医伦审通字〔2022〕42号。

1.2 药物与试剂达格列净(阿斯利康制药有限公司分装);吲哚美辛(上海麦克林生化科技股份有限公司);左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME,上海麦克林生化科技股份有限公司);碘海醇注射液(拜耳医药保健有限公司广州分公司);Cr、BUN、SOD、MDA测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);DAPI染色液(武汉博士德公司);Nrf2、HO-1抗体(美国Affinity BioReagents);荧光二抗(北京中杉金桥公司)。

1.3 仪器Multiskan Sky全波长酶标仪(美国Thermo Fisher 公司);UC90奥林巴斯成像系统(日本Olympus公司);BX43奥林巴斯荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 建立动物模型SD大鼠随机分为正常组、模型组、达格列净组,每组 6只。各组大鼠禁水24 h、禁食过夜后,给予模型组、达格列净组尾静脉注射吲哚美辛(10 mg·kg-1),15 min 后尾静脉注射L-NAME (10 mg·kg-1),再 15 min 后尾静脉注射碘海醇(1 600 mg·kg-1)[6]。给予正常组尾静脉注射生理盐水3次,每次间隔15 min,给药体积10 mL·kg-1。达格列净组于造模前2 h灌胃给予达格列净(参考文献用量[8]1 mg·kg-1,生理盐水溶解,浓度0.1 mg·mL-1)。正常组、模型组灌胃给予等体积生理盐水。造模完成后放入代谢笼留取24 h尿液。血肌酐水平在造影剂暴露后24～48 h增加≥25%或较其基础值升高≥0.5 mg·dL-1[2-3],则提示造模成功。

1.5 大鼠肾功能指标检测造模后24 h,腹主动脉取血并分离血清,按试剂盒方法测定Scr和BUN含量;采血后冰浴上迅速取两肾,一侧用10%福尔马林固定,另一侧用滤纸吸干水分后放-80 ℃冰箱中保存待用。收集不同实验组24 h尿液,测定24 h尿量、Ucr含量,计算肌酐清除率,肌酐清除率=(Ucr×24 h尿量)/(Scr×24×60×体重)。

1.6 肾组织SOD、MDA的检测 制备肾组织匀浆,3 000 r·min-1离心10 min,取上清液,按照试剂盒说明书步骤进行蛋白、SOD、MDA含量检测。

1.7 HE染色观察肾组织病理学改变肾组织固定后常规石蜡包埋、切片、HE染色,光学显微镜下观察。

1.8 肾组织Nrf2、HO-1免疫荧光染色肾组织固定后脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡至水,抗原热修复,封闭,孵育Nrf2、HO-1抗体(稀释比例为1∶100)、荧光二抗(稀释比例为1∶200),DAPI 染核,封片,荧光显微镜下观察照相,Image J 软件分析并计算平均光密度值。

1.9 统计学方法数据应用SPSS 22.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 达格列净对CIN大鼠肾功能指标的影响模型组Scr、BUN、Ucr含量较正常组显著增加(P<0.05或P<0.01),肌酐清除率显著下降(P<0.01);达格列净组Scr、BUN含量与模型组比较显著降低(P<0.01),肌酐清除率与模型组比较显著提高(P<0.05),结果见表1。

表1 达格列净对CIN大鼠肾功能指标的影响

2.2 达格列净对CIN大鼠肾组织SOD、MDA的影响 模型组肾组织SOD含量较正常组显著下降、MDA含量较正常组显著升高(P<0.01);达格列净组肾组织SOD含量较模型组显著升高、MDA含量较模型组显著下降(P<0.05),结果见表2。

表2 达格列净对CIN大鼠肾组织 SOD、MDA的影响

2.3 达格列净对CIN大鼠肾组织病理损伤的影响正常组大鼠肾小管结构正常,上皮细胞完整,无变性坏死;模型组大鼠肾小管上皮细胞空泡样变性、坏死;达格列净组大鼠肾小管上皮细胞空泡样变区域明显减少,结构相对完整。

2.4 达格列净对CIN大鼠肾组织Nrf2、HO-1表达的影响HO-1、Nrf2主要在肾小管细胞表达,造影剂肾损伤后皮质和髓质的小管细胞 HO-1、Nrf2表达均有轻度代偿性升高,达格列净干预后其表达量在皮髓质均进一步明显增多(与模型组比较P<0.01),结果见图2、表3。

图2 免疫荧光染色法观察各组肾组织Nrf2、HO-1表达情况(×200)

图2 各组肾组织病理损伤情况(HE,×200)

表3 达格列净对CIN大鼠肾组织Nrf2、HO-1表达的影响

3 讨论

随着影像技术及造影技术的发展,CIN的发生也呈现上升趋势。如何有效预防、治疗CIN已成为临床急需解决的问题。本实验运用吲哚美辛、L-NAME及碘海醇复制了CIN大鼠模型,结果显示造模后 24 h Scr较正常大鼠翻倍,提示造模成功。预防性给予达格列净后,Scr、BUN含量显著降低,肌酐清除率显著提高,病理结果显示达格列净组大鼠肾小管上皮细胞变性区域明显减少,表明达格列净对CIN具有一定的保护作用。

研究认为CIN的发生机制主要是肾髓质缺氧、氧化应激、肾小管上皮细胞和血管内皮细胞损伤及造影剂的毒性作用等[9]。正常机体存在着氧化与抗氧化的动态平衡,当体内大量的自由基无法清除,就会导致氧化应激与抗氧化平衡失调,引起细胞膜过氧化反应,从而引发疾病。SOD 能清除超氧阴离子自由基而保护细胞免受损伤,SOD活性的高低提示机体抗氧化能力的高低[10],造影剂能够减弱肾脏SOD的活性,导致氧自由基的产生增加,从而导致肾小管的损伤[11]。MDA是脂质过氧化过程中主要生成的一种醛类物质,MDA的含量可间接反映体内的脂质过氧化程度[12]。本研究结果发现,使用达格列净后,大鼠肾组织MDA降低,SOD活性升高,肾功能得到改善。据此,推断达格列净对CIN的保护机制可能通过抗氧化应激发挥作用。

大量研究表明Nrf2/HO-1通路是机体不可缺少的内源性保护系统,参与各种急慢性氧化应激的调节[13]。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子,当受到氧化应激信号刺激时,Nrf2与Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)解离,与抗氧化反应元件(ARE)ARE结合,激活Nrf2/ARE信号转导通路,启动受ARE调控的下游一系列靶基因(如HO-1等)的转录及表达,增强细胞的抗氧化应激能力[14-15]。HO-1是血红素代谢过程中的重要酶,具有抗氧化、抗炎的作用[16]。正常条件下,HO-1的含量与活性均处于较低水平,当机体受到低氧或者其他刺激处于应激状态时,机体可通过Nrf2/ARE通路启动HO-1表达,发挥抗氧化作用[15]。本实验结果表明达格列净可升高Nrf2、HO-l蛋白的表达,可能通过Nrf2/HO-1通路提高了大鼠抗氧化应激能力从而发挥肾保护作用。

综上,达格列净可以改善CIN模型大鼠肾功能,具有肾保护作用,这可能与达格列净提高大鼠抗氧化应激能力有关,但具体的作用机制尚需进一步探索研究。