片仔癀对酒精诱导的急性肝损伤小鼠自噬和NLRP3炎症小体活化的影响

许赞术,谭耀龙,张庆,黄贞伟,郑燕芳*,黄鸣清*

(1.福州市鼓楼区南街街道社区卫生服务中心,福建 福州 350001;2.广东医科大学附属东莞第一医院,广东 东莞 523121;3.福建中医药大学药学院,福建 福州 350122)

急性肝损伤(acute liver injury,ALI)是一种在临床上十分常见的肝脏疾病,由于肝细胞出现急性损伤或坏死而导致肝功能异常,其中部分患者还可出现肝衰竭[1-2]。炎症反应在急性肝损伤过程中扮演重要角色,其中NLRP3炎症小体活化并介导IL-1β以及IL-18成熟和释放是诱发急性肝损伤炎症级联反应从而导致肝脏损伤的重要分子机制[3-4]。细胞自噬是一种细胞自我保护机制,其通过自噬溶酶体清除胞内受损或衰老的蛋白质以及细胞器等,维持细胞内环境的稳定。近年来,研究发现自噬与炎症具有密切关联,一定程度上激活自噬可以抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应,进而缓解炎症反应带来的组织损伤[5-6]。因此,通过调控自噬来缓解急性肝损伤具有重要的意义。

片仔癀(Pien-Tze-Huang,PTH)是我国一种保密级的中成药,由珍贵药材麝香、蛇胆、牛黄以及三七等精制而成,具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛的功效,尤其对急慢性病毒肝炎等炎症性疾病具有很好的疗效[7-8],而且实验室前期研究发现PTH可通过促进自噬抑制NLRP3炎症小体介导的神经炎症以缓解脑卒中损伤[9]。但是,目前关于片仔癀对急性肝损伤的作用及可能机制的研究少有报道,因此本实验通过酒精建立急性肝损伤模型并给予PTH,观察片仔癀对急性肝损伤的保护作用,并初步明确其可能的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级别健康雄性C57BL/6小鼠30只(上海斯莱克实验动物责任有限公司,生产许可证:SCXK(浙)2019-2020,小鼠体质量为(20±2)g,小鼠饲养于福建中医药大学实验动物中心[合格证:SYXK(闽)2019-0007],一周适应性饲养后进行后续实验。本研究通过福建中医药大学动物伦理委员会审核批准,实验操作严格遵循动物福利相关规定。

1.2 实验药物与主要试剂片仔癀(漳州片仔癀药业股份有限公司,批号:2107105);酒精;谷草转氨酶测试盒(南京建成生物工程研究所,C010-2-1);谷丙转氨酶测试盒(南京建成生物工程研究所,C009-2-1);甘油三酯测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,A110-1-1);HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,G1120);反转录试剂盒(赛默飞,K1691);扩增试剂盒(赛默飞,A35495);一抗NLRP3(CST,15101)、Caspase-1 p20(CST,89332)、IL-18(CST,57058)、Beclin1(CST,3495)、LC3(CST,4599);二抗β-actin(CST,3700)和GAPDH(CST,5174)。

1.3 主要实验仪器倒置荧光显微镜(德国徕卡公司,DMi8);生物组织包埋机(江苏世泰实验器材有限公司,YB-6LF);生物组织脱水机(江苏世泰实验器材有限公司,TS-12D);生物组织摊烤机(江苏世泰实验器材有限公司,YT-7FB);石蜡切片机(美国赛默飞公司,HM325);Power PAC Basic电泳仪(Bio-Rad,1645050);Mini PROTEAT Tetra垂直电泳槽(Bio-Rad,1658001);Mini Trans-Blot转印槽(Bio-Rad,170-3930);ChemiDoc XRS+化学发光成像系统(Bio-Rad,1708265)。

2 方法

2.1 药物配置首先将片仔癀研磨成粉末,称取适量并加入2%吐温-80,制备成浓度分别为7.5、15、30 g·mL-1的混悬液备用;将适量酒精溶于蒸馏水中,配制成50%酒精溶液(现配现用)。

2.2 动物分组及给药将30只SPF级雄性C57BL/5小鼠随机分为5组(每组6只):空白组(Control)、模型组(酒精)、PTH低剂量组(75 mg·kg-1)、PTH中剂量组(150 mg·kg-1)和PTH高剂量组(300 mg·kg-1),连续灌胃给药3 d(2次/天)。空白组灌胃给予相应体积的蒸馏水。末次给药2 h后,模型组、PTH低、中、高剂量组灌胃50%的乙醇(0.12 mL/10 g),空白组灌胃相应体积的蒸馏水。造模后禁食不禁水,于24 h后取血和肝脏等。

2.3 AST、ALT和TG检测造模24 h后,小鼠摘眼球取血,室温静置1 h,然后于4 ℃离心机中离心10 min,转速为3 200 r·min-1,之后吸取上层血清至新的无菌EP管中,按照试剂盒说明书分别测量血清中AST、ALT和TG的含量水平。

2.4 苏木素-伊红染色颈椎脱臼法处死小鼠,剥离肝脏,然后用预冷PBS冲洗表面残留血液,取部分肝组织(0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm)固定。然后肝脏组织进行脱水透明、石蜡包埋与切片、切片脱蜡及复水,之后进行HE染色,再脱水封片,最后在光学显微镜下观察各组小鼠肝组织病理变化,并于200倍镜下拍摄代表区域。

2.5 qRT-PCR检测炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA转录水平小鼠处死后取肝脏组织,转移至预冷的研钵中研磨成粉,称取100 mg组织粉末,加入1 mL RNA提取剂,用2.5 mL注射器的针筒配合1 mL注射器的针头在冰上反复抽提,直至无明显组织块,于冰上静置15 min。离心取上清300 μL,并加入等体积异丙醇沉淀总RNA,之后用预冷75%乙醇洗涤两次,室温晾干后加入60 μL灭菌水并测浓度,反转录试剂盒制备cDNA,然后进行扩增(见表1)。目的基因相对含量=2-ΔΔCt,ΔΔCt=实验组ΔCt(目的基因Ct值-内参基因Ct值)-对照组ΔCt(目的基因Ct值-内参基因Ct值)。

表1 IL-6、IL-1β、TNF-α和GAPDH引物序列

2.6 Western blot法检测蛋白的表达水平取部分新鲜肝组织放入玻璃匀浆器中,加入2 mL含1%蛋白磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液,于冰上研磨至无明显组织块。静置30 min,收集组织液于预冷无菌EP管中,在4 ℃离心机中离心10 min,转速为14 000 r·min-1,后收集上清液并测浓度。然后加入5倍量蛋白上样缓冲液,并置于蛋白变性仪中变性,条件为100 ℃,15 min。然后上样、转膜、封闭,之后孵育一抗NLRP3、Caspase-1 p20、IL-18,Beclin1、LC3,4 ℃过夜,然后孵育二抗鼠或兔,最后ECL化学发光成像并保存图像,用Image Lab 6.0对数据进行分析和统计。

3 结果

3.1 片仔癀对酒精诱导小鼠急性肝损伤的保护作用结果显示,与空白组相比,模型组血清中ALT、AST和TG水平均明显升高,表明酒精刺激后,出现了急性肝损伤,肝脏功能受损(P<0.01);与模型组相比,给药组中ALT、AST和TG表达水平明显下降,表明PTH可缓解酒精导致的小鼠肝脏急性损伤(P<0.05、P<0.01),结果见图1。

图1 PTH对酒精诱导的肝损伤小鼠血清中AST、ALT、TG含量的结果

3.2 PTH对酒精诱导的急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响HE染色结果显示,空白组肝组织细胞排列整齐且肝小叶结构完整,中央静脉无扩张,门静脉区无变性、坏死以及炎性细胞浸润。模型组小鼠肝细胞排列紊乱,未见明显的肝小叶结构,肝窦有充血现象,中央静脉可见明显淤血扩张且有炎性细胞浸润,表明肝脏组织受到严重损伤。与模型组相比,片仔癀组小鼠肝小叶结构较为完整,炎性细胞浸润明显减少,中央静脉淤血扩张明显缓解,肝细胞结构比较完整,表明PTH可修复酒精诱导的肝脏组织病理损伤,结果见图2。

图2 PTH对酒精诱导的肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响(×200)

3.3 PTH对酒精诱导的急性肝损伤小鼠肝组织IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达水平的影响qRT-PCR结果显示,与空白组相比,模型组小鼠肝组织中IL-6、TNF-α和IL-1β mRNA转录水平明显上身,表明酒精导致了肝脏组织炎症反应(P<0.01)。与模型组相比,PTH组小鼠肝组织中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA水平明显下降,且呈现浓度依赖性,表明PTH可显著抑制炎症反应(P<0.05、P<0.01),结果见图3。

3.4 PTH对酒精诱导的急性肝损伤小鼠肝组织NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平的影响Western blot结果显示,与空白组相比,模型组小鼠肝组织中NLRP3、Caspase-1 p20和IL-18蛋白水平明显上升,表明NLRP3炎症小体活化(P<0.01);与模型组相比,PTH组小鼠肝脏组织中NLRP3、Caspase-1 p20和IL-18蛋白水平明显下降,表明PTH可抑制NLRP3炎症小体活化(P<0.05、P<0.01),结果见图4。

图4 PTH对酒精诱导的急性肝损伤小鼠肝脏中NLRP3、Caspase-1 p20和IL-18蛋白表达影响

3.5 PTH对酒精诱导急性肝损伤小鼠肝组织中自噬相关蛋白表达水平的影响Western blot结果表明,与空白组相比,模型组肝组织中蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及Beclin1蛋白水平均增加(P<0.01),表明酒精干预后自噬水平下降;与模型组相比,给药组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1的蛋白表达水平明显增加(P<0.05或P<0.01),表明PTH可促进自噬,结果见图5。

图5 PTH对酒精诱导的急性肝损伤小鼠肝脏组织中Beclin1和LC3蛋白水平的影响

4 讨论

酒精是一种常见的肝脏毒性物质,可导致酒精性急性肝损伤,常用于构建急性肝损伤模型。小鼠灌胃酒精后,血液中AST、ALT和TG等水平会明显增加,肝脏组织出现病理损伤等[1,10]。本研究灌胃酒精建立急性肝损伤模型并给予PTH进行干预,观察PTH对酒精性肝损伤的保护作用。结果显示,与空白组相比,模型组血液中AST、ALT和TG明显升高,HE结果显示模型组肝细胞结构紊乱,未见明显的肝小叶结构区域,肝窦有充血现象,且中央静脉可见淤血扩张,肝索排列紊乱,有炎性细胞浸润现象。表明酒精诱导了大鼠急性肝损伤。与模型组相比,给药组小鼠血液中AST、ALT和TG水平明显下降,且肝组织中炎性细胞浸润、细胞结构紊乱现象明显改善,表明PTH可以缓解酒精诱导的急性肝损伤。

NLRP3炎症小体是一种蛋白复合体,由受体蛋白NLRP3、接头蛋白ASC以及效应蛋白Caspase-1 p20组成,炎症发生后活化的NLRP3炎症小体可切割pro-IL-1β和pro-IL-18为成熟的IL-1β和IL-18,进而介导炎症级联反应[11]。本实验采用qRT-PCR和Western blot分别检测肝脏组织内相关炎症因子的mRNA以及NLRP3炎症小体相关蛋白水平。PCR结果显示,与空白组相比,模型组IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA水平明显上升,表明急性肝损伤后炎症反应激活;与模型组相比,PTH组中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA水平显著下降,表明PTH可抑制炎症反应。Western blot结果显示,与空组相比,模型组NLRP3、Caspase-1 p20和IL-18蛋白水平明显增加,表明模型组NLPR3炎症小体被活化;与模型组相比,PTH组NLRP3炎症小体相关蛋白表达明显下降,表明PTH可以显著抑制酒精诱导急性肝损伤中NLRP3炎症小体活化,进而抑制炎症级联反应。

细胞自噬与NLRP3炎症小体之间具有密切关系,自噬可以调控NLRP3炎症小体的活化,故其在抑制炎症反应中具有重要意义。Beclin1和LC3是自噬相关蛋白,在自噬溶酶体形成中发挥重要作用,是反应自噬水平的关键指标[12-13]。Western blot结果显示,与空白组相比,模型组中Beclin1蛋白表达水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上均下降,表明模型组自噬水平降低;与模型组相比,PTH组Beclin1蛋白表达水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显上升,表明PTH可显著促进自噬。

综上所述,片仔癀可能通过调控自噬通路来抑制NLRP3炎症小体活化以及炎症因子等释放,从而抑制酒精诱导的炎症级联反应,最终发挥改善急性肝损伤的作用。但是,本研究未探究PTH调控自噬的具体通路,后续实验需进一步阐明PTH作用机制。