基于蛋白质组学视角的疲劳相关生物学标志物研究进展▲

冯楚文 屈媛媛 孙忠人 孙维伯 李彬彬鲁 菁 邵玉莹 郭述豪 陈 涛 杨添淞

(1 黑龙江中医药大学附属第一医院康复科,黑龙江省哈尔滨市 150040; 2 黑龙江省中医药信息学重点实验室,黑龙江省哈尔滨市 150040;3 黑龙江中医药大学研究生学院,黑龙江省哈尔滨市 150040;4 哈尔滨医科大学第一临床医学院,黑龙江省哈尔滨市150040)

【提要】 目前有关疲劳领域的研究大多围绕慢性疲劳综合征、原发病伴疲劳、精神疲劳及运动性疲劳等4个方向开展,研究样本主要涉及血液、唾液、线粒体、脑脊液、细胞外囊泡及骨骼肌6种类型。目前,蛋白质组学技术不断发展,其已被逐渐应用于疲劳领域的研究。本文依据研究样本类型,对蛋白质组学在疲劳领域中的应用研究进行综述,旨在为揭示疲劳的疾病本质及精准诊治提供新的思路。

蛋白质组学是以蛋白为研究对象,通过高通量技术研究细胞、组织或生物体内蛋白的组成及变化规律,能够从整体水平系统了解在某一生理或病理状态下生命体内不同蛋白的表达、修饰及相互作用等。根据研究内容和目的不同,蛋白质组学可分为差异蛋白质组学、功能蛋白质组学和结构蛋白质组学,其主要研究策略可分为自下而上法和自上而下法,现已在多种疾病的研究中得到广泛应用[1-2]。疲劳既可作为一种独立的疾病,如慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome,CFS)[3]、运动性疲劳[4]等;也可以作为一种症状伴随原发病出现,如癌症后疲劳[5]、干燥综合征(Sjögren syndrome,SS)伴疲劳、多发性硬化伴疲劳等,严重影响患者的生存质量,但其病因和发病机制仍有待阐明。目前,有关疲劳发生机制的相关研究多以单个蛋白或单个通路为切入点,网络化、系统性研究报告较少[6]。随着蛋白质组学技术的快速发展,学者们已逐渐将其作为研究疲劳的重要技术手段,由于其能够全面展现疲劳相关蛋白质表达谱的变化特点,基于蛋白质组学筛选疲劳相关生物学标志物已成为该领域的研究热点,其研究结果对揭示疲劳的发病机制,建立疲劳诊断模型,寻找治疗靶标,判断疾病进展及预后具有重要意义。本文依据研究的样本来源,对蛋白质组学在疲劳领域中的应用研究进行综述,旨在为揭示疲劳的疾病本质及精准诊治提供新的思路。

1 血液蛋白质组学研究

血液是临床中最常见的检测标本,血液中的蛋白质变化情况可用于评估多种疾病发生和/或发展,是开展疲劳蛋白质组学研究的最常用样本。

1.1 血液蛋白质组学在CFS相关研究中的应用 Sweetman等[7]在11例CFS患者和9例健康对照者的外周血单核细胞中发现60种差异表达蛋白,并将具有相似蛋白表达谱的9例CFS患者作为CFS亚组,通过鉴定CFS亚组患者和健康对照者外周血单核细胞中的差异表达蛋白发现,部分差异表达蛋白在线粒体功能、氧化磷酸化、电子传递链复合物和氧化还原调节中发挥作用,与CFS的疲劳症状和运动后不适症状显著相关,而部分差异表达蛋白与CFS多种病理紊乱有关,如免疫炎症反应、DNA甲基化、细胞凋亡和蛋白酶体激活,这种蛋白表达层面的变化可能与CFS患者腺嘌呤核苷三磷酸产生不足,进而激活线粒体复合物Ⅴ上游通路产生相应的代偿机制有关。Germain等[8]对CFS女性患者和健康女性的血浆进行蛋白质组学分析,发现19种差异表达蛋白,这些蛋白的功能与细胞外基质、免疫系统和细胞间信号转导相关,其中Ephrin-A4蛋白在CFS女性中表达上调,而Eph-Ephrin信号-通路与CFS相关,且该通路参与细胞间信号传导,调节包括轴突引导、血管生成、上皮细胞迁移和免疫反应在内的多种生物过程。Milivojevic等[9]采用蛋白质组学技术分析39例CFS患者和41例健康对照人群血浆的蛋白表达谱,发现CFS与免疫失调密切相关;进一步行亚组分析发现,免疫球蛋白λ恒定区7与肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)阳性的CFS显著相关,而免疫球蛋白重链可变区3-23/30和免疫球蛋白κ可变区3-11与IBS阴性的CFS显著相关。此外,该研究团队通过对差异表达蛋白进行机器学习算法高精度预测,发现了多种可以预测CFS患者是否伴发IBS的重要蛋白[9]。Raijmakers等[10]采用多组学方法研究Q热综合征(Q fever syndrome,QFS)患者的肠道微生物组、血液代谢组和炎症蛋白质组的模式,并与CFS患者和健康对照人群进行比较,发现CFS患者比QFS患者更易出现炎症特征,炎症标志物4E-BP1、轴抑制蛋白1和基质金属蛋白酶1具有区分QFS、CFS与健康对照人群的潜力,通过机器学习进一步证实4E-BP1和轴抑制蛋白1可作为预测和诊断CFS的候选生物标志物。

1.2 血液蛋白质组学在原发病伴疲劳相关研究中的应用 Jensen等[11]将艾滋病患者分为逆转录治疗组和非逆转录治疗组,并根据患者的疲劳程度将上述两组患者分别分为非疲劳、中度疲劳和重度疲劳3个亚组,通过血浆蛋白质组学发现,载脂蛋白A1、载脂蛋白B、富含组氨酸的糖蛋白、α-1B糖蛋白和口腔黏膜蛋白2与艾滋病伴发疲劳有关;进一步验证发现,非逆转录治疗组中载脂蛋白A1表达量与患者的疲劳严重程度呈正相关,逆转录治疗组中载脂蛋白B表达量与患者的疲劳严重程度呈负相关,由此推测载脂蛋白A1和载脂蛋白B可能是艾滋病伴发疲劳的生物标志物。Bodewes等[12]在伴发疲劳的SS患者和未伴发疲劳SS患者的血清中发现了16种差异表达蛋白,包含突触体相关蛋白25、α-烯醇化酶、泛素羧基末端水解酶同工酶L1、白细胞介素-36α及多种补体因子等,这些差异表达蛋白与炎症反应、神经系统及代谢相关,受试者工作特征曲线分析结果提示有8种差异表达蛋白能够区分疲劳和非疲劳SS患者。Borren等[13]报告,伴或不伴疲劳的静止期炎症性肠病患者血清中存在28种差异表达蛋白,这些蛋白与炎症反应的关联性不强,由此认为由全身炎症反应引起静止期炎症性肠病患者持续疲劳的可能性较低。 Minton等[14]发现伴或不伴癌症相关疲劳综合征的乳腺癌患者血浆内存在7种差异表达蛋白,其中血清淀粉样蛋白A、聚集蛋白和免疫球蛋白G及补体C1Q亚单位属非特异性免疫反应相关蛋白,提示癌症相关疲劳综合征可能与持续非特异性炎症有关。Lukkahatai等[15]根据非转移性前列腺癌患者体外放射治疗前后的疲劳情况对其进行分组,血清蛋白质组学检查结果提示,治疗前后疲劳组载脂蛋白A1和载脂蛋白E水平均高于非疲劳组,非疲劳组平均甲状腺素运载蛋白水平均高于疲劳组,Western blot验证结果与蛋白质组学分析结果一致,推测它们可能是癌症治疗期间疲劳程度加重的潜在作用靶点。

2 唾液蛋白质组学研究

唾液是一种具有丰富生物学信息的体液,其成分的改变能够在一定程度上体现机体病理生理状态的变化,具有反映全身健康状况的巨大潜力。唾液作为蛋白质组学研究样本具有采集和处理方便、操作无创和成本较低等优势。约30%在血液中发现的蛋白也会出现在唾液中,但唾液中的蛋白组成复杂程度较低。唾液蛋白质组学是寻找疲劳相关生物标志物及研究发病机制的新途径。Ciregia等[16]在同卵双胞胎(1人患有CFS,1人作为健康对照)的唾液中鉴定出13种差异表达蛋白,这些蛋白参与炎症反应、免疫系统、代谢及信号转导等生物过程。该研究团队对同卵双胞胎的2次全唾液样本(间隔4年采集)进行差异表达蛋白Western blot验证后发现,其14-3-3蛋白ζ/δ、亲环素A、胱抑素C及S100-A7表达情况与蛋白质组学分析结果一致,推测它们可能是诊断CFS潜在的标志物[16]。Xu等[17]将连续工作18 h的47名急诊科医生作为研究对象,依据脑电图、焦虑及抑郁自评量表评分和Piper疲乏调查量表评分将研究对象分为疲劳组和非疲劳组,采集两组研究对象工作前后的唾液进行蛋白质组学检测,共筛选出30种疲劳相关差异表达蛋白,这些蛋白主要与免疫调节、炎性因子和炎症反应、代谢及肿瘤相关,基于研究结果建立的疲劳诊断模型的诊断正确率为95.7%,该结果可以为疲劳评估的定性和定量研究提供新模式。Michael等[18]通过蛋白质组学及定制软件分析疲劳标志物指数,发现参与研究的9名自行车运动员的唾液中含赖脯氨酸的蛋白上的2个7肽序列可作为评估疲劳的客观标志物。Dupree等[19]对精神疲劳患者开展精神疲劳与精神能量的关联性研究,发现精神疲劳前后仅有少数蛋白的表达水平发生改变,但未达到差异表达蛋白筛选标准,进一步分析发现精神能量与膜联蛋白A1表达水平呈负相关。虽然该研究样本量较小,但作为针对精神疲劳与精神能量关联性的探索性研究,其所得结论仍具有一定的参考意义。

3 线粒体蛋白质组学研究

线粒体作为真核细胞重要的细胞器之一,在细胞能量代谢、生物合成和细胞死亡中发挥关键的调控作用。线粒体功能障碍是CFS可能的发病机制[20]。Missailidis等[21]研究发现,CFS患者的淋巴母细胞存在线粒体复合物Ⅴ介导的腺嘌呤核苷三磷酸合成缺陷,由线粒体呼吸复合物、膜转运蛋白和脂肪酸β-氧化相关酶进行代偿性呼吸;其通过蛋白质组学鉴定发现,CFS患者淋巴母细胞线粒体内存在259种差异表达蛋白,包含多种参与磷酸戊糖途径及降解氨基酸的酶,富集通路与三羧酸循环、磷酸戊糖途径、线粒体脂肪酸β-氧化和多种降解氨基酸的酶相关,表明淋巴母细胞通过其他能量代谢途径代偿线粒体复合物Ⅴ的功能缺失;其还通过转录组学分析发现多种线粒体蛋白表达上调,可能与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号刺激相关。此外,该研究的多组学联合分析结果显示,CFS患者存在淋巴母细胞免疫途径的广泛激活,推测淋巴母细胞线粒体功能、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号及外周血单核细胞生存力参数均可以较为准确地筛选出CFS患者[21]。Ciregia等[22]在同卵双胞胎(1人患有CFS,1人作为健康对照)血小板线粒体中鉴定到41种差异表达蛋白,经功能分析后对乌头酸合酶(aconitate hydratase,ACON)、ATP合酶亚基β(ATP synthase subunit beta,ATPB)和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDHM)进行Western blot验证,验证结果显示上述3种蛋白在同卵双胞胎全唾液中的表达情况与线粒体蛋白质组学分析结果一致;在45名CFS患者及45名健康对照者的全唾液中,ATPB和ACON的表达情况与线粒体蛋白质组学分析结果一致,而MDHM的表达情况与线粒体蛋白质组学分析结果不一致,受试者工作特征曲线分析结果显示,全唾液中的ATPB与ACON联合诊断CFS的敏感性和特异性最高。可见,通过蛋白质组学研究线粒体功能的变化,能够从生物能量角度解释反复出现疲劳的原因,有助于了解CFS的发病机制,并为寻找以线粒体为靶标的治疗手段提供参考依据。

4 脑脊液蛋白质组学研究

当中枢神经系统发生病变时,脑脊液中的蛋白成分会发生变化。CFS为一种神经系统疾病,已有多项研究表明CFS该疾病患者存在脑结构和功能的变化[23-24]。Schutzer等[25]对CFS患者、治疗后神经系统莱姆病(nervous post-treatment Lyme disease,nPTLS)患者及健康对照人群的脑脊液进行蛋白质组学研究,结果显示,与健康对照人群相比,CFS患者和nPTLS患者的补体级联相关蛋白表达均上调,轴突引导相关蛋白表达均下调,其中,nPTLS患者补体级联相关蛋白C1S、C4B、C1QB和C1QC表达上调的程度高于CFS患者,CFS患者轴突引导相关蛋白表达下调的程度较nPTLS患者更明显,且在CFS患者和nPTLS患者中鉴定到的蛋白富集通路有所不同,上述研究结果为鉴别CFS和nPTLS提供了神经生物学证据支持。Valko等[26]发现伴有疲劳的多发性硬化患者和未伴有疲劳的多发性硬化患者的脑脊液中存在7种差异表达蛋白,通过Western blot和狭缝杂交验证发现伴有疲劳的多发性硬化患者的神经细胞黏附分子L1样蛋白、蛋白激酶C结合蛋白NELL2和Reelin蛋白表达下调,与蛋白质组学分析结果一致,推测这些蛋白可能通过改变突触可塑性和能量稳态参与多发性硬化相关疲劳的进展。Larssen等[27]在伴有轻度和重度疲劳的SS患者的脑脊液中筛选出15种差异表达蛋白,包括载脂蛋白A4、溶血素、色素上皮衍生因子、分泌素-1、分泌素-3、硒结合蛋白1和补体因子B等,它们在先天免疫调节、细胞应激防御及维持中枢神经系统功能中具有重要作用。另有研究表明,CFS患者脑脊液中可见溶血素、色素上皮衍生因子和分泌素-3表达[22]。综上所述,脑脊液蛋白质组学研究能够从分子层面对CFS患者的中枢神经系统生理及病理变化进行剖析,有助于寻找疾病的诊断和治疗靶点。

5 细胞外囊泡蛋白质组学研究

细胞外囊泡是经细胞膜融合分泌到细胞外环境中的微小囊泡,根据来源、性质和特征可将其分为微泡、外泌体和凋亡小体3类。细胞外囊泡作为细胞间的通信媒介,通过将与细胞增殖、凋亡及免疫调节等相关的信号传递至靶细胞而影响靶细胞的表型和功能。Eguchi等[28]的研究结果显示,CFS患者循环血中细胞外囊泡数量低于健康对照人群,在CFS患者细胞外囊泡中有75种CFS相关性差异表达蛋白,在CFS患者、抑郁症患者和特发性疲劳患者细胞外囊泡中发现134种CFS相关性差异表达蛋白,这些差异表达蛋白与局部黏附、肌动蛋白细胞骨架调节、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶信号通路及人类疱疹病毒4型感染相关;表达倍数位列前3的差异表达蛋白为肌动蛋白-1、丝蛋白-A和肌动蛋白,位列前12的差异表达蛋白与肌动蛋白网络蛋白家族和14-3-3蛋白质家族关系最为密切。该研究还发现,细胞外囊泡数量和细胞外囊泡特异性蛋白肌动蛋白-1、丝蛋白-A和14-3-3蛋白家族可作为区分CFS、特发性疲劳及抑郁症的标志物[28]。Cohn等[29]采集36名连续工作12 h的内科医生工作前后的唾液,并对其外泌体进行蛋白组学及转录组学分析,筛选出工作前后表达存在显著差异的14种蛋白,其中磷酸甘油酸激酶-1与疲劳密切相关,其表达受miR-3185调控,可能影响机体的疲劳状态。可见,基于细胞外囊泡蛋白表达变化开展研究,可能是寻找CFS生物标志物的新思路。

6 骨骼肌蛋白质组学研究

骨骼肌蛋白质组学研究主要包括骨骼肌细胞蛋白成分整体分析、骨骼肌蛋白合成降解紊乱相关蛋白的识别与鉴定,以及各种因素对骨骼肌的影响。Zhao等[30]对大鼠运动性疲劳过程中骨骼肌蛋白质组的变化进行研究,发现运动性疲劳大鼠骨骼肌内存在10种差异表达蛋白,包括与疲劳密切相关的参与能量代谢的甘油醛-3-磷酸脱氢酶和肌肉组织蛋白肌动蛋白,Western blot验证结果也进一步表明定量蛋白质组学具有较高的准确性。熊群[31]根据跑台运动时间将大鼠分为抗疲劳能力较强组和抗疲劳能力较差组,虽未发现两组大鼠血清血红蛋白、腓肠肌乳酸脱氢酶及琥珀酸脱氢酶的表达存在差异,但蛋白质组学结果显示两组大鼠腓肠肌中存在14种差异表达蛋白,包括3种结构蛋白和11种功能蛋白,推测大鼠抗疲劳能力与腓肠肌结构和功能蛋白表达变化有关。综上所述,开展骨骼肌蛋白质组学研究有利于发现与骨骼肌病理改变相关的诊断及预后指标,可用于运动性疲劳生物学标志物筛选及发病机制研究。

7 小结与展望

蛋白质组学技术有助于筛选疲劳相关生物学标志物,为疲劳的早期诊疗及抗疲劳药物研发提供新思路。但目前该技术在疲劳领域中的应用研究主要以非靶向蛋白质组学为主,研究结果多处于生物学标志物发现阶段,所得结果亟待进一步验证。未来应聚焦现有研究发现的疲劳相关生物标志物,扩大研究规模,完成靶向蛋白质组学验证;通过数据共享建立疲劳相关蛋白质组学数据库,形成蛋白网络功能系统化分析模式,并引入机器学习实现对疲劳的诊断及预后的预测,为针对作用靶标研发新药物提供证据支持;在蛋白质组学的基础上,联合多组学技术,从多维度探索疲劳的疾病本质。相信随着蛋白质组学技术的发展,该技术将在疲劳领域研究中发挥更大的作用。