研磨对大豆分离蛋白的物理改性研究

刘 悦,代养勇*,曹 健,侯汉学,王文涛,张 慧,丁秀臻,李 诚

1.山东农业大学 食品科学与工程学院, 山东 泰安 271018 2.山东省粮食加工技术工程技术研究中心, 山东 泰安 271018 3.河南工业大学 生物工程学院, 河南 郑州 450001

大豆分离蛋白(soybean protein isolate, SPI)作为一种优质廉价的植物蛋白质,可以提供人体生长和修复所需的必需氨基酸。SPI作为多种蛋白的混合体,主要含有2S、7S、11S、15S 4类蛋白质。其中,7S(β-伴大豆球蛋白)和11S(大豆球蛋白)占70%以上,其紧密的球状结构不利于蛋白溶解性、起泡性和成膜性等功能优势的发挥,限制了SPI的应用范围[1]。

目前,食品行业主要通过物理改性[2]、化学改性[3]、酶法改性[4]及其他新方法(主要是基因工程)来改变蛋白结构进而达到改善功能品质的目的。物理改性是在不改变蛋白质氨基酸序列的情况下,通过人为控制条件改变蛋白质分子的高级结构和分子间的聚集状态来改善它的功能特性[5],具有蛋白质营养损失少、操作过程简单、改性成本低、耗时短、无毒副作用等优势[6]。与物理改性相比,化学改性的蛋白含有较多的副产物,产品存在一定的安全隐患;酶法改性成本较高;而其他新方法改性的蛋白在短时间内难以确保食品安全性问题。Bi等[7]通过高剪切均质处理SPI分散体后发现分散体的粒径显著减小,蛋白的多分散性能和凝胶性能得到改善。Sharafodin等[8]通过介电阻挡放电(DBD)等离子体技术处理SPI后,发现SPI的乳化性能、溶解性、持水性和发泡性能均得到增强,且在18 kV等离子体处理15 min时效果最好。

干法研磨作为一种安全且环保的高效物理改性技术,通过反复高能的冲击和摩擦致使材料变性,不仅能够增强表面性质,而且能够改善食品的某些加工性能[9-10]。而关于干法研磨对蛋白物理改性方面的研究相对较少。基于此,作者以商品型SPI为原料,利用干法研磨技术对其进行物理改性处理,研究不同研磨时间对SPI结构、起泡性能和成膜性能的影响,以期寻求一种拓宽SPI在食品中的应用范围的物理改性新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆分离蛋白:山东禹王生态食品有限公司;大豆油:中国益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司;所用化学试剂均为分析级。

1.2 仪器与设备

ST-Q200型球磨机:北京旭鑫仪器设备有限公司;Lumina型荧光-磷光分光光度计、Nicolet iS5型傅里叶变换红外光谱仪:美国Thermo Fisher Scientific公司;JC2000C1型接触角测量仪:上海中辰数字技术有限公司;T18 digital Ultra-T型高速分散均质器:德国IKA公司;HWS-60型恒温恒湿试验箱:上海精宏实验设备有限公司;CR-400型色度计:日本Konica Minolta公司;W3/030型水蒸气透过率测试仪、XLW(CP)型拉伸测试仪:济南兰光机电技术有限公司;Quanta FEG250型扫描电子显微镜:美国FEI公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆分离蛋白的改性

将160 g SPI与800 g研磨球放入研磨罐内,设定球磨机转速为400 r/min,在25 ℃进行不同时间(0、3、6、9、12、15 min)的研磨处理。为防止较长时间的研磨使SPI的温度升高,每研磨3 min暂停2 h以保证研磨罐冷却至室温条件。研磨结束后将蛋白粉末放入自封袋内,4 ℃保存,备用。

1.3.2 三级结构的测定

根据Jiang等[11]使用的测定方法并稍做修改。使用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液配制1 mg/mL蛋白溶液。在25 ℃下,以5 nm的狭缝宽度,295 nm的激发波长,10 nm/s的扫描速度测定300～450 nm处的荧光光谱。

1.3.3 亲水性、亲油性的测定

将2.00 g蛋白粉末压成光滑的薄片,分别以去离子水、大豆油做润湿试验样品。采用悬滴法测定液滴与SPI薄片表面的接触角。

1.3.4 起泡性能的测定

将3%的SPI溶液用高速分散均质器在10 000 r/min下均质3 min后迅速倒入量筒内,并于均质结束0 min、10 min时测定量筒内泡沫的体积。起泡能力(foaming capacity, FC)和泡沫稳定性(foam stability, FS)的计算公式如下。

FC=V0/V×100%,FS=V1/V×100%,

式中:FC为起泡能力,%;FS为泡沫稳定性,%;V0为均质结束0 min时泡沫的体积,mL;V1为均质结束10 min时泡沫的体积,mL;V为均质前溶液的体积,mL。

1.3.5 成膜性能的测定

1.3.5.1 大豆分离蛋白膜的制备

根据Cheng等[12]使用的制备方法并稍做修改。在磁力搅拌2 h的5% SPI悬浮液中加入4 g甘油(40% SPI)制备SPI的成膜液。搅拌脱气1 h,向培养皿(直径150 mm)中浇注40 g成膜液。在25 ℃、55%的恒温恒湿条件下干燥24 h,剥离薄膜并放于自封袋中保存备用。膜性能测定前,需将薄膜放在25 ℃、55%的恒温恒湿条件下调节72 h。

1.3.5.2 膜的结构性表征

使用带衰减全反射采样附件(iD5 ATR)的傅里叶变换红外光谱仪,以4 cm-1的光谱分辨率在400～4 000 cm-1的范围内扫描32次。每扫描一个样品前都需要收集一次背景[13]。

1.3.5.3 膜的颜色参数及透明度

以白色标准板为参照物,通过色度计在薄膜的任意5点进行测定,获取颜色参数L*(明暗)、a*(红绿)和b*(蓝黄)和总色差(ΔE)[13]。薄膜的透明度则以600 nm处的吸光度与薄膜厚度的比值表示。

1.3.5.4 膜的水分含量、总可溶性物质和水蒸气渗透性

薄膜的水分含量(moisture content, MC)和总可溶性物质(total soluble matter, TSM)根据Muoz等[14]使用的测定方法进行测定。薄膜的水蒸气渗透性(water vapor permeability, WVP)根据Zhai等[15]使用的测定方法通过水蒸气透过率测试仪进行测量。在38 ℃、相对湿度90%条件下,在12 h内,每隔2 h将直径80 mm的无磨损、无褶皱的圆形薄膜样品称重一次。

1.3.5.5 膜的拉伸强度和断裂伸长率

膜的拉伸强度(tensile strength, TS)和断裂伸长率(elongation at break, EAB)根据Zhai等[15]使用的测定方法(稍做修改后)通过XLW(CP)拉伸测试仪进行测量。测试过程中,两个夹具之间的原始标距设置为50 mm,并以100 mm/min的速度拉伸,直至破裂。

1.3.5.6 膜的微观形貌

用双面透明胶带将SPI薄膜固定在支架上,并通过离子溅射仪为其表面镀一层铂金膜。通过调节电镜选取最佳拍摄视野后观察并拍摄照片。

1.3.6 数据处理及分析

采用Origin 8.0软件绘制图表,采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(ANOVA,P<0.05),数据由平均值±标准偏差(n=3)表示。

2 结果与分析

2.1 研磨时间对SPI结构的影响

当SPI的分子构象发生改变时,其芳香族氨基酸与周围基团的相互作用也会发生改变,导致荧光强度和最大发射波长(λm)发生改变[16]。通常,拥有较高荧光强度和较短λm的SPI处于折叠状态,而拥有较低荧光强度和较长λm的SPI处于部分或者完全未折叠状态[17]。由图1可知,研磨处理后,SPI的荧光强度降低,且λm发生了红移。表明研磨处理改变了SPI的三级结构,使处于折叠状态的SPI发生了去折叠,同时SPI内部的发色团(主要是疏水发色团色氨酸(Trp)残基和酪氨酸(Tyr)残基,其次还有苯丙氨酸(Phe)残基)更多地转移至分子外部并暴露于溶剂中[18]。当研磨处理15 min时,荧光强度最低,λm红移程度最大。然而,研磨6 min的SPI的荧光强度要高于3 min的,且λm发生了蓝移。这是因为SPI发生了聚集,导致发色基团被重新掩埋。当蛋白去折叠后,疏水基团暴露程度增大,蛋白质的亲油性能得到一定程度的改善,这可能影响SPI的起泡特性、乳化特性、薄膜表面的疏水性能[19]。

图1 不同研磨时间下的SPI的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectroscopy of SPI with different grinding time

2.2 研磨时间对SPI亲水性、亲油性的影响

SPI表面润湿性(亲/疏水性)可以通过接触角来评估,它对蛋白质的应用特性具有重要的参考意义[20]。由图2可知,随着研磨时间的延长,SPI的亲水性能先增强后减弱。在研磨处理6 min时,SPI的亲水性能达到最强(71.55°)。这是因为短时间的研磨处理使蛋白质分子适度舒展,蛋白质内部的部分极性基团暴露,使亲水性能增加。但经过长时间(9～15 min)的研磨处理后,蛋白分子的舒展程度过大导致大量的疏水基团暴露,反而使其亲水性能降低[21]。由图3可知,随着研磨时间的延长,SPI的亲油性能较未经处理的有所提升。这是因为研磨处理后,蛋白质紧密的球状结构被打开,蛋白质内部的疏水基团充分暴露。但是,当研磨6 min时,蛋白质中出现的聚集导致疏水基团被部分掩埋,使SPI的亲油性能略有下降。

注:A—F分别为研磨0、3、6、9、12、15 min。图3、图6同。图2 SPI表面的水接触角光学照片Fig.2 Water contact angle of the surface of SPI with different grinding time

图3 SPI表面的油接触角光学照片Fig.3 Oil contact angle of the surface of SPI with different grinding time

2.3 研磨时间对SPI起泡性能的影响

起泡能力和泡沫稳定性是衡量物质是否适用于充气食品的关键评估指标[22]。由图4可知,研磨处理后,SPI的FC和FS有所提升。当研磨15 min时,SPI的FC增加至156.21%,FS增加至82.33%。这是因为研磨处理后,蛋白质紧密的球状结构被打开,具有了较为灵活的结构,有利于提升蛋白质的界面吸附能力。但是,当研磨6 min时,蛋白质中出现的聚集阻止了蛋白分子的展开,这并不利于界面蛋白质的吸附,使SPI的FC(131.24%)和FS(62.71%)略有下降。

图4 不同研磨时间下的SPI的起泡性及泡沫稳定性Fig.4 Foaming capacity and stability of SPI with different grinding time

2.4 研磨时间对SPI成膜性能的影响

2.4.1 薄膜的结构

所有SPI薄膜的红外光谱都显示出了与SPI骨架结构相对应的特征谱带。在3 274 cm-1附近主要与O—H和N—H的拉伸振动(酰胺A峰)有关[23],在1 537 cm-1附近主要与C—N拉伸振动和N—H弯曲振动(酰胺Ⅱ峰)有关。由图5可知,随着研磨时间的延长,SPI膜的酰胺A峰和酰胺Ⅱ峰转移到低波数方向。当研磨15 min时,这两个峰的位置分别转移至3 271 cm-1和1 531 cm-1。这说明研磨处理后的SPI在制备薄膜的过程中,会形成更多的氢键,有助于制备具有更均匀表面、更好机械性能、更具凝聚力的SPI薄膜[24]。当研磨6 min时,酰胺A峰和酰胺Ⅱ峰略微转移到高波数方向。这说明蛋白质中出现的聚集会阻止蛋白分子的展开,并不利于薄膜中氢键的形成。

图5 不同研磨时间下的SPI制备的薄膜的FT-IR光谱Fig.5 FT-IR spectroscopy of the films prepared by SPI with different grinding time

2.4.2 薄膜的光学特性

薄膜的颜色参数(L*、a*、b*和ΔE)是影响消费者接受度的重要因素。由表1可知,研磨处理使L*增加,a*和b*减小。说明与未经处理的SPI制备的薄膜相比,研磨处理能够使薄膜具有更强的白色和减弱的黑色、绿色和黄色。在研磨15 min时,ΔE达到了2.74。Saricaoglu等[23]研究发现高压均质处理使蛋白粒径降低,薄膜颜色发生了相同改变。这表明研磨处理可以达到和高压均质处理相同的效果。

表1 不同研磨时间下的SPI制备的薄膜的光学特性Table 1 Optical properties of films prepared by SPI with different grinding time

透明度数值越高,薄膜越不透明或浑浊[25]。由表1可知,未经研磨处理的SPI膜的透明度为0.88,研磨处理后薄膜的透明度显著降低。当研磨15 min时透明度下降至0.52。这是因为研磨处理后,SPI能够更加均匀地分散在成膜液中,膜具有更加均匀、致密的微观结构。研磨处理6 min时,薄膜的透明度略增。这是因为蛋白质中出现的聚集导致成膜液的均匀性较差,使制备的膜轻微变暗,并使光线难以穿过基质,膜较不透明[26]。

2.4.3 薄膜的物理化学性质

由表2可知,研磨使SPI薄膜的MC显著降低。当研磨15 min时,MC显著降低至21.62%。这是因为研磨处理使SPI的结构展开,有助于创造更多的蛋白质空间,使增塑剂(甘油)能够更多地渗透到蛋白质网络中,增强了甘油和SPI的羟基和酰胺基之间的氢键,从而降低了SPI和水分子之间的相互作用,因而在干燥过程中会损失更多的水分。由表2可知,研磨处理后,SPI薄膜的TSM与未处理的TSM没有显著性差异。这与高强度超声制备豌豆分离蛋白膜中TSM结果相同[26]。出现上述现象的原因可能是在SPI薄膜的制备过程中,表面疏水性的增加对薄膜TSM的影响与溶解度的增加对TSM的影响可能相互抵消,从而导致薄膜的TSM没有出现显著性差异。

表2 不同研磨时间下的SPI制备的薄膜的物理化学性质和机械性能Table 2 Physicochemical properties and mechanical properties of films prepared by SPI with different grinding time

同时,研磨处理后,SPI薄膜的WVP显著下降,这是因为研磨处理后,由于蛋白质结构的改变,内部的疏水基团大量暴露,降低了水分子通过薄膜网络结构时的吸附和扩散速率[27]。同时因为研磨后的SPI薄膜更均匀致密,孔隙或裂缝更少,所以WVP也会下降。

2.4.4 薄膜的机械性能

薄膜的实用性在很大程度上受到TS和EAB的影响。由表2可知,当研磨15 min时,SPI薄膜的TS和EAB均增大(2.24 MPa、178.70%),这是因为研磨处理后,SPI的结构发生了改变,增加了蛋白质与蛋白质、蛋白质与甘油之间的相互作用,这有助于薄膜三维网络的形成。在薄膜干燥阶段,分子间会形成更多的二硫键、疏水键和氢键,使薄膜的机械性能得到改善[28]。在研磨处理6 min时,SPI薄膜的TS和EAB略微减小,这是因为蛋白质发生的轻微团聚并不利于蛋白质与蛋白质、蛋白质与甘油之间的相互作用。在薄膜干燥阶段,形成的二硫键、疏水键和氢键较少,从而影响了薄膜的机械性能。

2.4.5 薄膜的微观结构

扫描电子显微镜可以用来观察SPI薄膜的微观结构。由图6可知,未经研磨处理的薄膜表面较为平坦,但呈现出了较多的非连续裂纹,这会降低薄膜的机械性能(表2)。当研磨处理3～6 min时,薄膜表面较为粗糙,表面出现凸起,但薄膜表面的裂纹变少,结构变得更加致密、均匀。其中,研磨处理6 min时的薄膜表面会有较多的未溶解颗粒沉积,可见,此时蛋白质确实发生了轻微团聚。随着研磨时间的延长(9～15 min),薄膜表面未见明显裂纹,结构更加致密、均匀,同时机械性能显著提高(表2)。可见,研磨处理能够改善薄膜的微观结构,使薄膜结构更加致密、均匀。

图6 不同研磨时间下的SPI制备的薄膜的扫描电镜图Fig.6 SEM characterization of the films prepared by SPI with different grinding time

3 结论

通过对SPI进行研磨处理,得到不同处理时间的蛋白样品,并对蛋白的结构、性质和成膜性能进行研究。结果表明,研磨处理后,SPI紧密的球状结构发生了去折叠,蛋白内部的疏水基团充分暴露,蛋白质具有了更高的疏水性能。由于蛋白结构的改变,提升了蛋白质的界面吸附能力,SPI的起泡性能得到改善。通过对薄膜相关性能进行测定后发现,研磨处理能够显著改善SPI薄膜的成膜性,薄膜表面的裂纹变少,结构变得更加致密、均匀,薄膜的光学性能、物理化学性能和机械性能得到提升。作者制备了一种高起泡和较强成膜性能的大豆分离蛋白,可为今后研究植物蛋白绿色改性技术奠定理论基础。此外,由于功能性质之间存在关联性,研磨处理对大豆分离蛋白其他功能性质(乳化特性、凝胶特性等)的影响及其作用机理尚不明确,有待于进一步研究。